来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程研究

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题目：来源于巨大芽孢杆菌ALA2的
细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程研究
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摘要
细胞色素P450酶系是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系。

来源于巨大芽孢杆菌（Bacillus. megaterium）的细胞色素P450 BM-3可以快速催化链长大约C12~C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性，其中对C15和C16脂肪酸的活性最高。

编码P450 BM-3的基因（CYP102）已被克隆并在大肠杆菌中得到表达，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。

本实验采用来源于巨大芽孢杆菌ALA2的细胞色素P450 BM-3基因进行蛋白质工程设计，按此依据进行定点突变和重组表达，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比。

相比于野生型细胞色素P450 BM-3，F87L对吲哚显示了较高的活性，酶活提高约6.98 %，由此证明Phe87对反应选择性控制起着关键的作用，是影响该酶表达量和表达活力的主要因素。

并为进一步探索体外合成的细胞色素P450 BM-3进行生物催化应用打下较好的基础。

关键词：巨大芽孢杆菌，P450 BM-3，F87L，吲哚
The study on protein engineering of the cytochrome P450 BM-3 from B. megateriumm ALA2
Abstract
Cytochrome P450 is a kind of metabolic enzymes which are widely distributed in animals, plants and microorganisms. Cytochrome P450 BM-3 from B. megateriumm shows high monooxygenase activity for long chain saturated fatty acid(12-18 carbons), especially fatty acid with 15 and 16 carbons are the highest.
P450 BM-3 encoding gene (CYP102) has been cloned and expressed in E. coli, the purified P450 expressed from E. coli has the same function, immunochemistry and electrophoresis characteristic with the purified P450 BM-3 from B. megateriumm, and their N-terminal sequences are also consistent.
The study usesd the cytochrome P450 BM-3 gene from B. megateriumm ALA2 for protein engineering design, according to which we conducted site-directed mutagenesis and recombination expression,and compared with the original gene expression in E. coli. F87L shows a litter higher activity towards indole than wild-type P450 BM-3, and the enzyme activity has increased by 6.98%, which proved that Phe87, playing a key role in the control of reaction selectivity, is the major factor influencing the enzyme expression and activity. The study also lay a good foundation to further exploration of cytochrome P450 BM-3 mutant for biocatalysis application.
Keywords: Bacillus. Megaterium,P450 BM-3,F87L,indole
目录
摘要 (I)
Abstract ........................................................................................................................................... I I 前言 (1)
1 文献综述 (2)
1.1 细胞色素P450 (2)
1.1.1 细胞色素P450的酶系组成 (2)
1.1.2 细胞色素P450的结构折叠 (2)
1.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别 (3)
1.1.4 细胞色素P450的天然底物 (3)
1.1.5 细胞色素P450的催化反应 (4)
1.1.6 细胞色素P450基因的简化结构 (5)
1.2 细胞色素P450 BM-3 (6)
1.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源 (6)
1.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构 (6)
1.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导 (7)
1.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应 (7)
1.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用 (7)
2 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达 (10)
2.1 实验材料 (10)
2.1.1 主要仪器 (10)
2.1.2 菌株与质粒 (11)
2.1.3 培养基与储液 (11)
2.1.4 主要试剂 (13)
2.2 实验方法 (14)
2.2.1 突变位点的选择 (14)
2.2.2 引物设计 (14)
2.2.3 反向PCR反应 (15)
2.2.4 PCR产物纯化 (16)
2.2.5 琼脂糖凝胶电泳 (17)
2.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化 (17)
2.2.7 DNA浓缩 (18)
2.2.8 DNA磷酸化 (18)
2.2.9 质粒的自身环化 (19)
2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备 (19)
2.2.11 重组质粒电击转化 (20)
2.2.12 质粒提取 (21)
2.2.13 重组细胞色素P450 BM-3酶活检测 (21)
2.2.14 细胞色素P450 BM-3酶活测定 (22)
2.2.15 纯度鉴定方法 (22)
3 实验结果与讨论 (25)
3.1 定点突变重组子的构建 (25)
3.2 突变基因测序结果与分析 (25)
3.3 重组质粒验证 (26)
3.4 粗酶液SDS-PAGE分析 (26)
3.5 酶活的初步测定 (27)
3.6 氨基酸突变结果讨论 (29)
结论 (30)
展望........................................................................................................... 错误！未定义书签。

致谢. (31)
参考文献 (31)
前言
20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，可作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键，发生具有较高的区域选择性和立体选择性单加氧反应。

因此，细胞色素P450被认为是精细化工合成的潜在催化剂。

然而，它们本质上不是很活跃，表现出较差的稳定性，需要如铁氧化还原蛋白，黄素单核苷酸还原酶和NAD(P)H作为电子转移的相关因子。

细菌细胞色素P450相对比较稳定，具有高活性，并且运用重组表达系统往往可以大量准备。

来源于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450 BM-3是一种经研究最好的细菌的P450，P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。

1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体。

相比于其他P450s其性能更接近应用需求。

但很多的研究表明，该酶有十分明确的底物特异性。

为了获得对除了以长链不饱和脂肪酸为底物的反应活性，细胞色素P450 BM-3的蛋白质工程被广泛地研究。

目前定向进化技术在改变酶功能特性和构建具有新的功能特性的酶中显示出巨大的潜力，比如P450 BM-3(A74G,F87V,L188Q)突变体能够催化吲哚生成靛蓝，这是野生型P450 BM-3所不具有的催化功能。

大肠杆菌（E.coli）具有①表达水平高，②繁殖周期短，③容易操作，④有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用等优点，因此常用于P450的表达。

本研究运用定点突变手段对细胞色素P450 BM-3进行改造，并和原始基因在大肠杆菌中表达情况进行对比，找出影响该酶表达量和表达活力的主要因素，为进一步探索细胞色素P450 BM-3进行体外生物催化应用打下较好的基础。

本研究在药物开发，生物降解和生物催化过程具有十分重要的意义，加氧酶的应用也具有广泛的市场前景。

1 文献综述
1.1 细胞色素P450
细胞色素P450，是一类与重金属结合的配体，形成的酶在生物细胞通过可逆性的变化而进行电子传递。

因它与一氧化碳结合后，在450 nm处有吸收峰，故有此名[1]。

细胞色素P450广泛分布在脊椎动物或无脊椎动物（包括昆虫）、植物和微生物中。

在生命过程中，内源物质的代谢与转化或外源化合物的活化与降解等都需要细胞色素P450酶系的催化与调控。

由于该酶系的性质和功能及其在生命活动中它的作用，因此在药理学和毒理学的研究中它一直是引人关注的重要研究领域。

1.1.1 细胞色素P450的酶系组成
细胞色素P450是广泛分布于动物、植物和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，作为功能单位，该酶系由多种组分组分组成。

目前已知的细胞色素P450酶系的主要组分包括两种细胞色素（细胞色素P450和细胞色素b5）、两种黄素蛋白（即NADPH-细胞色素P450还原酶和NADH-细胞色素b5还原酶）以及磷脂等，其中细胞色素P450和细胞色素P450还原酶最为重要。

1.1.2 细胞色素P450的结构折叠
通常P450有4个β-折叠，大约是13个α-螺旋，其中β5是可变的。

P450保守的结构核心由螺旋束D、E、I、L及螺旋J、K组成。

螺旋I包含高度保守的苏氨酸。

N-端有酸性残基，位于活性中心吡咯环B的上方。

螺旋K含完全保守的E-X-X-R，可能参与稳定核心结构，位于血红素近侧（即假定的氧化还原个搭档结合侧）。

螺旋L构成血红素结合区的一个部分。

有两套结构保守的β-折叠，一为β-折叠1，包含5个股（strands）；另一为β-折叠2，包括两个股；这些折叠有助于形成疏水性的底物进入通道[1]。

所有P450具有结构保守的共有序列（consensus sequence），位于血红素的近表面包含完全保守的半胱氨酸（Cys），它是血红素铁的第五个配体，也是CO-结合蛋白在450 nm 有特征Soret吸收的原因。

在蛋白质的近表面还有一卷曲成为曲（meander），其结构高度保守，以前称为芳香区（aromatic region）。

因此，变异较大的结构元件是螺旋A、B、B'、F、G、H、K'、β-折叠3和4以及环（loop）。

这些可变区包含与底物特异性有关的部分。

图1.1 细胞色素P450的结构图
Figure1.1 The structure of P450
1.1.3 细胞色素P450的底物结合与识别
以上提到的非保守区或可变区通常与底物结合部位和氧化还原搭配（Peterson）结合部位相连。

比较CYP2家族和P450 cam的序列，Gohoh(1992)鉴定出参与底物识别的区域，以底物识别部位（substrate recognition sites，SRS）加数字命名。

与底物结合相连的可变区是螺旋A、B、B'、F和G以及他们毗邻的环。

环B-B'和B'-C形成活性中心1（SRS-1），螺旋F和G及它们的环形成活性中心的“进入通道”和顶（ceiling）（SRS-2和SRS-3）。

β-折叠4末端的β转角（β-turn）深入活性中心（SRS-6），β-股（1-4）的N-末端区（SRS-5）也伸入活性中心。

另一个与底物结合相连、在反应机制中重要区域是保守的、螺旋I的中心部分（SRS-4）。

以上区域的大多数实际在P450酶的血红素/活性中心，参与底物在囊中的定向。

螺旋A、F-G环和β-股1-1和1-2似乎参与底物识别[1]。

1.1.4 细胞色素P450的天然底物
细胞色素P450具有很广的底物谱（表1.1）既包括许多外源物质如抗体、植物次生性物质及合成有机化合物，也包括多种甾醇和其他生理过程产生的脂类。

人类制造的环境化合物大多数是P450的可能底物，还有许多可作为P450 同工酶的诱导剂和抑制剂[3]。

表1.1 细胞色素P450的底物
Table1.1 The substrates of cytochrome P450 BM-3
外来物
生理过程相关 药物（含抗生素）
甾醇 致癌物
类花生四烯酸 抗氧化剂
脂肪酸 添味剂
丙酮，丙酮醇 溶剂
脂过氧化氢 农药
类视黄酸 染料
麻醉剂
石油产品
醇类
1.1.5 细胞色素P450的催化反应
细胞色素P450与底物的总反应可以用下式表示： RH O 2ROH H 2O
2e , 2H P450
RH 代表底物，在催化反应过程中分子氧（O 2）裂解形成水和羟基化的代谢产物（ROH ）。

反应中需要两个电子和两个质子。

在线粒体和许多细菌中，电子是从NADH 或NADPH 通过依赖FAD 的还原酶来传递到铁-硫铁氧还蛋白。

然而，在微粒体内质网系统中，NADPH 传递电子是通过含黄素蛋白的FAD 和FMN ，即细胞色素P450氧化还原酶，无需Fe 2S 2氧还蛋白的中介作用，而b 5也可能是提供第二个电子的来源。

有关各种P450系统的电子传递途径（Takemori et al.,1993）（图1.3），（1）中还原的吡啶核苷酸首先还原含FAD 的铁氧还蛋白还原酶，再将电子传递到铁氧还蛋白。

铁氧还蛋白为还原酶和P450之间的电子穿梭（shuttle ）转移。

（2）中NADPH-P450还原酶含FAD 和FMN 作为辅基，其中FAD 为从NADPH 来源的电子受体，FMN 为还原的FAD 和P450电子转移的中间体[1]。

图1.2 （1）为线粒体的电子转移系统。

（2）为微粒体的电子转移系统。

Figure1.2 （1）The electron transfer system of mitochondria.（2）The electron transfer system of microsome.
细胞色素P450酶（CYPs）是一类含血红素的单加氧酶，它几乎存在于所有的生命有机体中。

在NADPH或NADH 的辅助下，细胞色素P450酶可以催化一些疏水化合物的单氧化甚至还可以在非活性的C-H键引入氧原子，如作用于烷烃、脂肪酸、萜类、甾族化合物的惰性碳氢键产生具有较高区域选择性和立体选择性的单加氧反应。

其催化反应的范围很广，因此CYPs是一类具有很强应用前景的生物催化剂。

细胞色素P450酶系的循环催化反应（图1.4）（Porter et al.,1991）。

其中Fe表示活性部位中血红素的铁原子，RH代表底物，RH(H)2代表还原产物，ROH为单氧化作用产物，XOOH 代表过氧化物作为交替的氧供体[1]。

图1.3 P450作用机制
Figure1.3 The mechanism of P450
1.1.6 细胞色素P450基因的简化结构
细胞色素P450基因的简化结构（图1.4）：
图1.4 P450基因的简化结构
Figure1.4 The simple structure of P450 gene
1.2 细胞色素P450 BM-3
20世纪70年代中期从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）中发现了具有脂肪酸羟基化活性的P450，已从芽孢杆菌中将P450 BM-3纯化到同质，它能对链长大约C12~C18饱和脂肪酸及相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺发生羟基化或环氧化反应。

1.2.1 细胞色素P450 BM-3的来源
目前已从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）ATCC14581中检测出2个P450活性。

P450 BM-1和P450 BM-2可被巴比妥（barbiturate）诱导，P450 BM-1的Barbie盒位于5'侧翼区。

P450 BM-1是含410氨基酸，分子质量为48 kDa的蛋白，与P450cam最相似。

P450 BM-2是48 kDa脂肪酸羟化酶。

P450 BM-1，BM-2，BM-3在B. megaterium 12个ATCC株的11个都存在，但在ATCC13368中未检测出，该菌株包括一个类型1的P450（P450meg），它可以在15β位置羟基化不同的甾醇[1]。

1.2.2 细胞色素P450 BM-3的结构
P450 BM-3分子质量很大，119 kDa，仅需底物和NADPH就有全活性。

1 mol纯化的P450 BM-3包含1 mol FAD、FMN和血红素，可以催化细胞色素C以及其他人工电子受体[1]。

水解酶部分水解P450 BM-3得到两个结构域，其中66 kDa多肽包含两分子黄素，保持还原酶活性；另一结构域为55 kDa的血红素结构域，可与底物结合，也可与CO结合，在450 nm有吸收峰。

P450 BM-3被认为是两个结构域的融合蛋白，这两个结构域分别对应于真核生物微粒体P450酶系的组成成分即P450和NADPH P450还原酶。

图1.5 细胞色素P450 BM-3的催化域入口
Figure1.5 The catalytic domain entrance of cytochrome P450 BM-3
1.2.3 细胞色素P450 BM-3的表达与诱导
编码P450 BM-3的基因CYP102已被克隆并在大肠杆菌中得到表达[4]，从大肠杆菌中表达的P450经纯化后与从巨大芽孢杆菌（B. megaterium）纯化的P450 BM-3有相同的功能、免疫化学和电泳特征，其N-末端序列也一致。

P450 BM-3可被IPTG诱导，在培养基中加入0.5~1.0 mM的IPTG便可以诱导P450 BM-3的表达。

巴比妥、芳基脲和酰胺也是P450 BM-3的诱导剂。

1.2.4 细胞色素P450 BM-3的催化反应
细胞色素P450 BM-3有十分明确的底物特异性，它快速催化链长大约C12~C18的饱和脂肪酸的单加氧酶活性其中对C15和C16脂肪酸的活性最高[5,6]。

其他底物包括相似链长的单不饱和脂肪酸、脂肪族醇和脂肪酰胺，脂肪酸酯不是P450 BM-3的底物。

脂肪酸底物的羟基化作用一般在ω-2位置，也可发生在ω-1和ω-3。

棕榈酸羟基化产物可以进一步作氧化作用的底物而进一步羟基化。

不饱和脂肪酸的双键也可被环氧化[4,15]。

1.2.5 细胞色素P450 BM-3的基因重组研究与应用
应用有关P450活性位点的研究成就，有可能重新设计P450的活性部位以结合和催化
P450的非天然底物。

P450底物结合囊的细微改变，可以改变P450的底物特异性和催化效率，通过修饰P450酶可以用于选择性氧化非活性碳氢化合物。

1.2.5.1 改变底物特异性和催化效率
目前已有研究表明，通过蛋白质设计或定向进化技术，可以将P450 BM-3酶转变成另一种酶，这种酶可以催化一类在结构上与它的天然底物基本无相似的化合物。

不仅可以提高其对于酚类化合物的催化活性（如2,6-二氯酚），而且还可以提高其区域选择性，从而催化只产生一种产物[10]。

综合利用蛋白质设计和定向进化技术得到的另一种三重突变体，其催化β-紫罗酮的活性大约是野生型酶的80倍，该酶的转换数可达到260 min-1，而且主要是产生（R）-4羟基-β紫罗酮（其对映体过量率为40%），这种产物可以作为一种食用香料。

1.2.5.2 改变反应产物形成
在P450 BM-3位于“进入通道”入口处的β-股1-1和1-2的β-转角上的精氨酸47（R47）突变研究发现，该位点如为酸性残基则完全抑制与花生四烯酸的结合，而如突变为丙氨酸，则降低底物结合达五倍[1]。

R47突变可使产物的形成也发生变化，野生型P450 BM-3产生80%的18-羟基二十碳三烯酸（18-HETE），R47A突变体只有66%HETE，而14,15-环氧二十碳三烯酸（14,15-EET）则由野生的20%变为R47A突变体的30%。

但如在活性中心发生F87V突变（B'-C环），14,15-EET的产量由野生型的20%变为突变体的100%。

Oliver等发现精氨酸47突变为谷氨酸可以产生烷基三甲基铵（alkyltrimethylammonium）羟化活性。

1.2.5.3 增强区域选择性和催化活性
Arnold和他的同事综合利用定向进化、蛋白质模型和定点突变的方法来改变P450 BM-3酶的特性，得到一系列的突变体，分别用于催化十二烷烃、辛烷、己烷、丙烷和乙烷的羟基化。

P450 BM-3酶其中的一种突变体具有一个最佳的还原酶区域，它可以直接将乙烷氧化成乙醇，但催化效率比较低，耦合效率也小于1%。

鉴于P450 BM-3酶和其突变体的广泛用途，许多研究者尝试着将其催化的反应放大。

比如用P450 BM-3酶催化亚麻酸来工业化生产15(R),16(S),9,12-环氧十八二烯酸（对映体过量率60%）[11]，在优化的反应条件下，这种酶表现出很高的区域选择性和催化活性。

图1.6 细胞色素P450 BM-3选择性环氧化亚麻酸
Figure1.6 Cytochrome P450 BM-3 shows selective epoxidation towards linolenic acid
1.2.5.4 增强酶的稳定性和催化效率以及耦合效率
通过研究P450 BM-3酶在水-环己烷双相系统中的作用效应，该系统是利用NADP+依赖型甲酸脱氢酶来提供回收辅因子。

结果发现，假如加入稳定因子，如牛血清白蛋白和过氧化氢酶，P450 BM-3酶可保持活性长达100 h，而且催化产物只有环己醇[13]。

在该双相系统中，P450 BM-3酶突变体则表现出更高的稳定性和催化效率，在依赖NADPH的环己烷羟基化反应中，该突变体酶有很高的催化活性。

利用定点突变的方法使得P450 BM-3的还原酶区接受NADPH，这样的突变体也有上述的特性。

研究证明，NADPH依赖型的单加氧酶突变体在合适的条件下可以表现出很高的稳定性和催化效率以及高耦合效率（有的高达60%）。

2 细胞色素P450 BM-3基因克隆及其在大肠杆菌中的表达2.1 实验材料
2.1.1 主要仪器
表2.1 主要仪器及来源
Table2.1 Main instruments and manufacturer
仪器名称型号生产厂家
梯度PCR仪MasterCycler Gradient 5331德国Eppendorf
Bio-photometer 6131 德国Eppendorf
核酸电泳仪DYY2-C 北京六一
蛋白电泳仪VE-180 上海天能
凝胶成像系统Quantity One 170-8171 美国Bio-Rad
-86 ℃超低温冰箱U410-86 英国New Brunswick Scientific 旋涡振荡器V ortex Genie 2 美国Scientific Industries
电子天平AY120 日本岛津自动蒸汽灭菌锅D-1 AUTO CLA VE 北京发思科贸
超净工作台VS-1300L-U 苏州安泰
生化培养箱SP-300B 南京恒裕恒温培养振荡器ZHWY-2102C 上海智城
高速冷冻离心机X-22R 美国BECKMAN
水浴振荡器THZ-82 常州国华企业
电热鼓风干燥箱PHG-9123A 上海精宏冰箱BCD-518WS 海尔集团
2.1.2 菌株与质粒
宿主菌为E. coli TOP10。

质粒载体为pTrc99A，原始重组质粒由本实验室构建。

2.1.3 培养基与储液
（1）LB 培养基（1000 mL）：
液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。

固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，琼脂粉15 g。

搅拌使之完全溶解，用NaOH 调pH 至7.0，高压灭菌20 min（121℃ 0.1 Mpa)
（2）SOB 培养基（1000 mL）：
20 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，0.5 g NaCl，加入约800 mL的去离子水，溶解后加入10 mL 250 mmol/L KCl溶液（将1.86 g KCl 用100 mL 去离子水溶解即配成250 mmol/L KCl 溶液），用5 mol/L NaOH调节pH值至7.0（约0.2 mL），定容至1 L。

在15 psi（1.05 kg/cm2）高
溶液（用90 mL 去离温高压灭菌20 min，4 ℃保存。

使用前加入5 mL灭菌的2 mol/L MgCl
2
子水溶解19 g MgCl2，用去离子水溶解19 gMgCl2，用去离子水调整体积为100 mL，在15 psi （1.05 kg/cm2）高压下蒸汽灭菌20 min）。

（3）SOC培养基
向100 mL SOB培养基中加入2 mL过滤除菌的1 mol/L 葡萄糖溶液混合均匀，4℃保存。

（4）氨苄青霉素储存液
用无菌双蒸水配成100 mg/mL，过滤除菌，分装于-20℃保存。

（5）10×TBE琼脂糖凝胶电泳缓冲液
称取Tris 108 g，Na2EDTA·2H2O 7.44 g，硼酸55 g，加蒸馏水定至1 L，室温保存，使用时稀释10倍。

（6）碱裂解质粒小提试剂
（a）SolutionⅠ
分别取25 mL 1 mol/L Tris·HCl（pH 8.0），20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0），45 mL 20% glucose（W/V），加ddH2O定容至1 L。

121 ℃灭菌20 min，4℃保存。

使用前每50 mL的SolutionⅠ中加入2 mL的RNase A（20 mg/mL）。

（b）SolutionⅡ
分别取50 mL 2 mol/L NaOH，50 mL 10% SDS（W/V），加灭菌水定容至500 mL。

室温保存。

此溶液保存时间不要超过一个月。

同时，SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

（c）SolutionⅢ
称取147 g KOAc，加入300 mL去离子水后搅拌溶解，加入57.5 mL CH3COOH，用去离子水定容至500 mL。

121℃灭菌20 min，4 ℃保存。

（7）SDS-PAGE蛋白电泳试剂
（a）30%丙烯酰胺凝胶贮备液
称取29.2 g丙烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，加水至100 mL，通风橱操作，过滤后棕色瓶避光保存。

（b）1.5 mol/L Tris·HCl分离胶缓冲液（pH 8.8）
称取18.15 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至8.8，加水至100 mL，4℃保存。

（c）0.5 mol/L Tris·HCl浓缩胶缓冲液（pH6.8）
称取6 g Tris，用l mol/L HCl调pH值至6.8，加水至100 mL，4℃保存。

（d）10% SDS溶液
称取10 g SDS，加水至100 mL，完全溶解后室温保存。

（e）50%GY
量取50 mL甘油，加水定至100 mL，室温保存。

（f）1%溴酚蓝
称取100 mg溴酚蓝，加水定至10 mL，过滤后4℃保存。

（g）10%过硫酸铵
称取1 g过硫酸铵，溶于10 mL水中，贮于4℃，使用不可超过2周。

（h）5×Loading Buffer
取1.2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），2.5 mL甘油，1 g SDS，50 mg溴酚蓝，加去离子水定至10 mL，分装成小份（500 μL/管），贮于室温。

用前每小份中加入25 μL的β-巯基乙醇，加入β-巯基乙醇之后可在室温保存1个月。

（i）电泳缓冲液（pH8.3）
称取3 g Tris，18.8 g甘氨酸，1 g SDS，定容至1 L，室温保存。

（j）染色液
称取1 g考马斯亮蓝R-250于1 L烧杯中，加入250 mL异丙醇搅拌溶解，再加入100 mL 冰乙酸和650 mL水，混匀，过滤后室温贮存。

（k）脱色液
量取100 mL冰乙酸，50 mL乙醇，850 mL水，混匀后室温贮存。

2.1.4 主要试剂
表2.2 主要试剂及来源
Table2.2 Main reagents and manufacturer
试剂生产厂家
DNA 聚合酶TAKARA
T4 DNA 连接酶TAKARA
电泳级琼脂糖OXOID 琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒BIOMIGA
质粒小提试剂盒BIOMIGA
氨苄青霉素南京天为时代
过硫酸铵SCIGENE
酵母提取物OXOID
胰蛋白胨OXOID
葡萄糖国药集团上海化学试剂公司
琼脂粉南京基天生物技术有限公司三羟甲基胺基甲烷（Tris）ANGUS
EDTA 国药集团上海化学试剂公司
NaCl 南京化学试剂有限公司
NaOH 南京化学试剂有限公司
MgCl2南京化学试剂有限公司
HCl南京化学试剂有限公司
2.2 实验方法
2.2.1 突变位点的选择
爱丁堡大学化学系，细胞及分子生物学研究所和斯特拉斯克莱德大学理论及应用化学系的Tobias等[14]探索了对P450的底物结合部位进行理性设计的可能性。

他们所使用的模型为结合了棕榈酸的P450 BM-3酶。

为我进行定点突变提供了结构指导。

如图2.1所示，P450 BM-3肽链中第87位的苯丙氨酸残基，位于活性中心且高度保守，侧链上的苯环可以改变活性区域（疏水通道）的构象，并且指导脂肪酸的取向。

突变此点可以改变P450 BM-3的底物选择性和立体区域选择性。

图2.1 细胞色素P450 BM-3和底物棕榈酸对接
Figure2.1 The modeling of cytochrome P450 BM-3 and substrate docking
2.2.2 引物设计
本实验通过DNA序列测定确定了突变位点碱基序列的变化，以及碱基对应氨基酸的变化。

由于易错PCR方法的不可预见性，决定采用定点突变的方法，通过反向PCR对细胞色素P450 BM-3进行定向改造。

通过在设计引物时人为改变碱基序列实现细胞色素P450 BM-3的定向进化，本实验因时间有限，只将细胞色素P450 BM-3活性中心87位残基上的苯丙氨酸进行定向改造。

图2.2 一步反向PCR法致点突变原理示意图
Figure2.2 Schematic diagram of o ne-step opposite direction PCR method 引物设计如下：
F87突变的引物序列：
上游引物5'-GTCCAGCTTGT NNN TAAACCGTCTCC-3'
下游引物5'-GCCGAAAAAAAACTGGAAAAAAGCGC-3'
加粗体下划线的碱基表示人为引入突变位点。

设计好的引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.2.3 反向PCR反应
以设计的质粒为模板，PCR反应体系的组成：
表2.3 PCR反应体系
Table2.3 PCR reaction system
成分加量（µL）
ddH2O32.5
5×PrimeST AR TM Buffer 10.0
dNTP 10 mmol/L 4.0
P1 10 µmol/L 1.0
P2 10 µmol/L 1.0
Templates 1.0 PrimeST AR TM HS DNA Polymerase（2.5 U/µL）0.5
Total50.0
按下列程序进行PCR循环扩增：
表2.4 PCR反应程序
Table2.4 PCR reaction program
步骤温度（℃）时间（min）
Stage1 95 5
Stage2（32cycles）
95 1 52.6 1 72 7.5
Stage3 72 15 直接进行下一步实验或将PCR扩增产物置4℃保存。

2.2.4 PCR产物纯化
为降低产物浓度，采用BIOMIGA的PCR产物纯化试剂盒进行纯化。

具体步骤为：（1）收集4℃保存的PCR反应液。

（2）加入2倍体积的Buffer GC（如50 µL的PCR反应液，加入100 µL Buffer GC），混合均匀。

（3）将上述混合液（每次不超过700 µL）移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。

重复步骤（3），直到剩余的混合液全部通过吸附柱。

（4）加入650 µL DNA Wash Buffer至吸附柱中，室温下，13,000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回到收集管中，重复步骤（4）一次。

（5）室温下，13,000 rpm，将吸附柱开盖离心2 min，去除残留的乙醇。

（6）将吸附柱放入干净的1.5 mL离心管中，在吸附柱膜中央加入30～50 μL Elution Buffer或ddH2O，室温放置1 min。

13,000 rpm离心1 min，离心管中的液体即为包含目的DNA片段的溶液，取2～5 μL进行电泳检测浓度，纯化好的DNA可立即用于后续实验或于-20℃冻存。

2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
（l）琼脂糖凝胶的制备
称取0.2 g琼脂糖，置于三角瓶中，加入20 mL 1×TBE缓冲液（胶浓度1 %），电炉加热至琼脂糖完全溶解，冷至60℃左右时，加入核酸染料至终浓度为0.5 μg/mL，摇匀后倒入事先插好梳子的制胶槽中，轻微晃动使胶液面平整，室温放置约40 min使胶完全凝固，然后小心拔去梳子，将胶放入盛有1×TBE缓冲液的电泳槽中。

缓冲液应没过胶面约5 mm，且加样孔靠近电泳槽负极。

（2）加样
将5 μL DNA样品与1 μL 6×Loading Buffer混匀，小心加入加样孔中，同时加入DL 10，000或1kb ladder Marker。

（3）电泳
接对电泳槽正负电源线，打开电泳仪电源，设定100~120 V恒压电泳，待溴酚蓝前沿跑至距凝胶正极端约1 cm左右时停止电泳。

（4）成像
将胶置于凝胶成像系统（BIO-RAD）中，紫外光下拍摄图像，并进行条带分析。

2.2.6 目的片段和载体割胶回收纯化
用1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外照射下，切下目标DNA。

从琼脂糖凝胶中回收DNA 采用BIOMIGA的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（离心柱型）回收DNA。

（1）在紫外灯下用干净锋利的手术刀片切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5 mL离心管中，计算凝胶块的重量。

（2）每100 mg琼脂糖凝胶加入不少于100 μL Buffer GC，于50～60℃温浴10 min，每2～3 min间断混合，直至凝胶完全融化。

（3）将上述混合液移至一个带有收集管的吸附柱中，室温下13,000 rpm室温离心1 min，取出吸附柱，并倒掉收集管中废液，将吸附柱放回到收集管中。

重复步骤（3），直。