色谱分离理论

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色谱分离理论
如何评价色谱分离的好坏? 如何评价色谱分离的好坏?或者说色谱 分析追求的目标什么? 分析追求的目标什么? 分离度、分析时间、样品量? 分离度、分析时间、样品量?
优化色谱分离的目标是实现混合物的 完全分离,涉及到各组分色谱峰之间的 相互关系,是一个与热力学和动力学有 关的综合性问题。因此文献上提出许多 不同的多元混合物色谱分离的优化指标。
补充材料
可见,单独用柱效 选择性 柱效或选择性 柱效 选择性不能真实反映组分在色 谱柱中分离情况,故需引人一个综合性指标——分离度 R。分离度是既能反映柱效率又能反映选择性的指标, 称总分离效能指标,分离度又叫分辨率。
R =
t r 2 t r1 1 (w1 + w 2 ) 2
=
2 ( t r 2 t r1 ) w1 + w
多组分分离
色谱法的最大优点是能对含多组分(几十到几百个) 色谱法的最大优点是能对含多组分( 几十到几百个) 的样品进行分析。 的样品进行分析。 若样品只含数个组分, 且它们的k没有很大差别, 若样品只含数个组分, 且它们的k没有很大差别, 可 通过增加理论塔板数, 通过增加理论塔板数 , 改变相对保留值和流动相速度 来实现分离。但对于一些复杂情况 , 采用固定的一组 来实现分离 。 但对于一些复杂情况, 条件往往难于达到最佳分离。例如, 条件往往难于达到最佳分离。例如, 样品含多个k值差别很大组分。在这种情况下, ⑴ 样品含多个 k值差别很大组分 。 在这种情况下 , 若 设计等温或等度洗脱实验条件, 不能达到最佳分离。 设计等温或等度洗脱实验条件, 不能达到最佳分离。 在色谱图上所确定的空间里, ⑵ 在色谱图上所确定的空间里, 要分离的组分太多而 容纳不下, 超过色谱图的峰容量。 容纳不下, 超过色谱图的峰容量。
在等温条件下, 对给定色谱柱, k和 为常数, 在等温条件下, 对给定色谱柱, k和α为常数, 分离度决定于理论塔板数。 分离度决定于理论塔板数。使两组分达到某一分 离度所需的塔板数, 可由下式计算: 离度所需的塔板数, 可由下式计算:
1 + k2 2 N 2 = 16 R ( ) ( ) α 1 k1
对于一个具体的色谱分离, 值应该多大 值应该多大? 对于一个具体的色谱分离,k值应该多大?
(3)分离因子
是柱选择性的量度。 越大, 柱选择性越好, α是柱选择性的量度。α越大 柱选择性越好 越能 获得良好分离。从以下一组数据, 观察α 的影响: 获得良好分离。从以下一组数据 观察α对R的影响: 的影响
② 不等高峰 要注意防止“交叉污染”。如h1 :h2 = 10 : 1, R = 1.0,A2的纯度由97.72 %降低为88 %。
Snyder & Kirkland 标准分离曲线 标准分离曲线: 峰高比1:1~128:1,R为0.4~1.25的分离图
补充材料
通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 通常用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志。 R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志 实际工作R要多少? 实际工作R要多少?
k k/(1+k)
0.5
1.0
3.0
5.0 8.0
10
30
50
0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98
k k/(1+k)
0.5 1.0 3.0 5.0 8.0 10 30 50 0.33 0.50 0.75 0.83 0.89 0.91 0.97 0.98
可见, 过大的k(>10), 使k/(1+k)的改变不大 对R 的改变不大, 可见 过大的 的改变不大 的改进不明显, 反而使保留时间大为延长。 的改进不明显 反而使保留时间大为延长。 k改变的方法有 改变的方法有: 使k改变的方法有: 改变柱温( ● 改变柱温(如GC) ) 改变流动相性质和组成(在 中 ● 改变流动相性质和组成 在LC中) ● 改变相比
S
初始 t 增大k 增大 增大N 增大 改变α 改变α t 图8. k、N、α对分离的影响 、 、
(1)理论塔板数
● 当固定相确定以后, 要使一对组分的分离达到某一 个R值, 柱必须具有最低限度的理论塔板数,即最 最 低柱效。(初步实验有人常采用“ 柱子??? ???) 低柱效 (初步实验有人常采用“旧”柱子???) ● 增加柱长可以改进分离。但是柱长增加(同时压 力增大), 分析时间也随之增加, 峰宽也随保留 时间延长而增加, 因此, 单纯追求长柱不可取。 常规GC和HPLC柱长是多少?为什么? ● 增加N值也可改进分离度, 这意味着选择一根性 能优良的色谱柱, 并在最佳化条件下操作。 如何提高色谱柱的柱效?
time
R是色谱中两个组分分离好坏程度的标志。从色谱 分析的角度看,只有峰窄而间距大的分离是令人 满意的。在色谱分析中, 并不是要求R越大越好, 而 是追求最佳分离。
对于一个具体的色谱分离, 值应该多大 值应该多大? 对于一个具体的色谱分离,R值应该多大?
对于复杂样品的分析,所有待测组分的分辨率要
足够大( 2) 足够大( R > 2),才能满足定量分析的要求, 同时分离过程要尽可能短,保证痕量分析的灵敏
度。这就是色谱优化理论。
R作为相邻色谱峰重叠程度ห้องสมุดไป่ตู้量度, 有如下两种情况: ① 等高峰
R 1.5 1.0 0.8 0.5 tr(2)-tr(1) 6σ 4σ 3.2σ 2σ 峰纯度(%) 99.87 97.72 94.5 84.1 备注 基线分离
对于宽沸程的多组分混合物,可采用程序升温法, 对于宽沸程的多组分混合物,可采用程序升温法,即在分析过程中按一定速度提高柱 在程序开始时,柱温较低,低沸点的组分得到分离,中等沸点的组分移动很慢, 温,在程序开始时,柱温较低,低沸点的组分得到分离,中等沸点的组分移动很慢,高 沸点的组分还停留于柱口附近;随着温度上升,组分由低沸点到高沸点依次分离出来。 沸点的组分还停留于柱口附近;随着温度上升,组分由低沸点到高沸点依次分离出来。
改变组分的α值方法: 改变组分的α值方法:
改变固定相 使各组分的分配系数有较大差别。 ⑴ 改变固定相, 使各组分的分配系数有较大差别。 固定相 例如分离苯和环己烷, 若以邻苯二甲酸二壬酯作固定 例如分离苯和环己烷 值为1.5;而以β 氧二丙腈作固定液, 液, α值为 ;而以β, β‘-氧二丙腈作固定液 α值增 氧二丙腈作固定液 加至6.3。 加至 。 改变柱温 柱温。 ⑵ 改变柱温。柱温的改变对不同组分的分配系数的 影响不同。采用较低柱温 一般有利于增大α 影响不同。采用较低柱温, 一般有利于增大α值。 改变流动相的性质和组成。 ⑶ 改变流动相的性质和组成。 利用化学衍生法改变组分的性质 ⑷ 利用化学衍生法改变组分的性质, 从而改变它们 组分的性质 的分配系数。 的分配系数。
柱温 T℃ 或 Org.%流相 强溶剂A%
5 2 1
time
程序升温和梯度洗拖曲线
改变k的特殊方法 改变 的特殊方法: 在分离过程中, 柱温按预定速率, ⑴ 程序升温:在分离过程中 柱温按预定速率 随时间呈线性
或非线性增加, 以使各组分在最佳柱温下流出色谱柱。 或非线性增加 以使各组分在最佳柱温下流出色谱柱。程序升 温用于气相色谱。 温用于气相色谱。
分辨率公式:
R=
t r2 t r1 1 (W1 + W2 ) 2
=
2(t r2 t r1 ) W1 + W2
上式没有直接给出分辨率与色谱基本参数k和N的关系。 对于多组分混合物的分离分析, 通常特别关注最难 分离的相邻的色谱峰, 即物质对的分离。由于它们的 保留值差别较小, 可合理认为(!), W1 = W2 = W , 则 N2 α 1 k2 基本分离方程的推导 R= ( )( ) 4 1 + k2 α (1) ) 柱效因子 (2) ) 相对分离因子 (3) ) 保留程度因子
α (α-1)/ α 1.0 0 1.001 0.001 1.01 0.01 1.1 0.091 1.5 0.33 2.0 0.50
增加到1.1, 约增加 %, 而R却增加到原来 约增加9 α从1.01增加到 增加到 却增加到原来 增加道2.0, 约增加 %, 而R只增加到 约增加33 的9倍;α从1.5增加道 倍 增加道 只增加到 原来的1.5倍 原来的 倍。
12 S
3 4
(a)较低柱温或洗脱强度 (b)中等柱温或洗脱强度 (c)较高柱温或洗脱强渡
5 6
T
t 不同色谱条件的分离图 t
要解决多组分的分离问题, 必须采用一些特殊的分 要解决多组分的分离问题 , 必须采用一些 特殊的分 离技术。 离技术。 如上图,假定在开始分离时, 采用(a)的条件, 使 如上图,假定在开始分离时, 采用( 的条件, 组分1 在接近k= 的条件下得到快速而良好的分离。 k=2 组分1和2在接近k=2的条件下得到快速而良好的分离。 接着, 将条件从( 变到( 使组分3 接着, 将条件从(a)变到(b), 使组分3和4的k值也 减少至2左右, 得到良好分离。最后, 将条件从( 减少至 2左右 , 得到良好分离 。 最后 , 将条件从 ( b) 改到( 使组分5 良好分离。 改到(c), 使组分5和6良好分离。 峰宽连续增加, 在一般分离过程中 , 峰宽连续增加, 特别在分离后 阶段, 峰容量变小。采用( 这种特殊技术后, 阶段, 峰容量变小。采用(d)这种特殊技术后, 谱带 宽度在分离过程中维持不变, 宽度在分离过程中维持不变 , 因而在色谱图的有限空 间内, 可容纳更多的峰。由于峰变窄, 间内 , 可容纳更多的峰 。 由于峰变窄 , 有利于痕量组 分的检测, 而且使分析时间减少。 分的检测, 而且使分析时间减少。
2 2
α
(a)两色谱峰距离近并 且峰形宽。 且峰形宽 。 两峰严重相 叠 , 这表示选择性和柱 效都很差。 效都很差。 (b)虽然两峰距离拉开 但峰形仍很宽, 了 , 但峰形仍很宽 , 说 明选择性好, 但技效低。 明选择性好 , 但技效低 。 分离最理想, (c)分离最理想,说明 选择性好, 柱效也高。 选择性好 , 柱效也高 。 。
Sig
在色谱中相邻两组分 (“ 物 质 对 ” ) 的 分 离
度:
R=
t r2 t r1
1 (W1 + W2 ) 2
=
2(t r2 t r1 ) W1 + W2
time Sig
●热力学 保留值的差别 热力学:保留值的差别 热力学 要足够大 ●动力学:色谱峰要足够 动力学: 动力学 窄
time Sig
对于色谱分离, 值应该多大? 对于色谱分离, α值应该多大?
结论: 结论:
值很小的变化, 可使有较大的变化。 ① α值很小的变化 可使有较大的变化。 值趋近于1时 它的改变对的增加R尤为显著 尤为显著; ② α值趋近于 时, 它的改变对的增加 尤为显著;α 值较大时, 的影响反而减少。 值较大时 对R的影响反而减少。 的影响反而减少 k、N、 三个参数中, ③ 在k、N、α三个参数中, α的增加对分离的改 增加3, 只增加到原来的 只增加到原来的1.5倍 进最有效。k从1增加 R只增加到原来的 倍。N 从 增加 增加到原来的3倍 只增加到原来的1.7倍 增加到原来的 倍, 而R只增加到原来的 倍。 α从 只增加到原来的 1.01增加带 增加带1.1, 约增加 %, 而Rs却增加到原来的 约增加9 却增加到原来的9 增加带 却增加到原来的 倍。
2
(2)容量因子
R= N2 k2 α 1 ( )( ) 4 1 + k2 α
Q = n α 1 4 α
令:
则分离方程式为
k R = Q 1+ k
根据 tr = t0 (1+k) ,图中前 图中前 段时间曲线与事实不符! 时间曲线与事实不符!
补充材料
即固定相已选定, 即α已定, 为了达到良好分离, 适当增大k有利于分离。这体现在两方面: ● 柱长一定, 在给定操作条件下, N值一定, 此时k越 大, k/(1+k)也越大, R越大。 ● 分离度一定 如R = 1.5, k越大 达到该分离度所 分离度一定, 越大, 越大 需的N值越小 即所需柱子越短。但是k不是越大越 值越小, 需的 值越小 即所需柱子越短。但是 不是越大越 有利。观察以下数据: 有利。观察以下数据:
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