兔肋软骨脱细胞基质的制备

兔肋软骨脱细胞基质的制备
刘萌萌;张健;栾保华;孙良;李中华;王小霞
【摘要】背景:研究表明新西兰兔软骨组织可作为组织工程支架材料,中关节软骨及耳软骨的脱细胞基质的研究较多,采用肋软骨作为组织工程软骨支架的研究较少.目的:制备新西兰兔肋软骨脱细胞基质,讨天然软骨支架作为组织工程支架的可行性.方法:用联合去垢剂-酶法获得软骨支架,据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0,4,8,6 h分为4组.脱细胞完毕后各组支架固定行扫描电镜采集图像观察计算支架孔隙率、孔径长度,对支架进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,将脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下观察其相容性.结果与结论:兔肋软骨脱细胞基质呈乳白色,小均一,色示支架结构完整,保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分,描电镜观察经一定时间的脱细胞处理后可得到结构完整,隙均匀的天然软骨支架,孔隙率为(61.31±8.45) %;孔径长度为(32.80±5.15) μm,合正态性分布,组脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下7 d后生物相容性良好,围软组织无明显充血、化脓等炎症排斥反应出现.结果显示,肋软骨脱细胞支架具有良好的基质组成,较完整、均匀的孔隙结构及孔径分布,作为组织工程支架材料.%BACKGROUND:Several studies have suggested that New Zealand rabbits cartilage tissue can be used as a kind of tissue engineering scaffold material and is widely used in scientific research, including articular cartilage and ear cartilage cells of the matrix of the emergence of studies comparing fully, but adopting costal cartilages as tissue engineering cartilaginous framework of research little, yet few reports.OBJECTIVE:Based on the preparation of costal cartilage acellular matrix from New Zealand rabbits, to discuss the feasibility of natural cartilage matrix scaffold for tissue engineering scaffolds.METHODS:By
using detergent-enzyme method, cartilaginous framework was obtained, and acellular matrix was divided into four groups of 0, 24, 48 and 96 hours according to Triton X-100 second processing time. Scanning electron microscope was used for image acquisition to calculate stents porosity, pore diameter, and then the scaffolds underwent hematoxylin-eosin, toluidine blue and Ⅱ collagen type immunohistochemical staining. The compatibility of the acellular matrix scaffolds transplanted subcutaneously was observed.RESULTS AND CONCLUSION:The acellular matrix presented with milk-white, size uniformity with intact stained structure , and there were a lot of acid mucopolysaccharide and collagen type Ⅱ . The porosity was (61.31±8.45)％, and the pore diameter was (32.80±5.15)μm. The biocompatibility of the transplanted acellular matrix was good at 7 days after transplantation. No obvious hyperemia and purulent occurred. These findings show that there is a good substrate composition of rabbit coastal cartilage acellular matrix scaffolds with intact and even pore structure, which can be used as tissue engineering scaffold materials.
【期刊名称】《中国组织工程研究》
【年(卷),期】2011(015)016
【总页数】4页(P2881-2884)
【关键词】软骨;脱细胞;支架;生物相容性;组织工程
【作者】刘萌萌;张健;栾保华;孙良;李中华;王小霞
【作者单位】山东大学附属省立医院烧伤整形科,山东省济南市,250021;山东大学附属省立医院烧伤整形科,山东省济南市,250021;山东大学附属省立医院烧伤整形科,山东省济南市,250021;山东大学附属省立医院烧伤整形科,山东省济南
市,250021;济南市第四人民医院烧伤科,山东省济南市,250021;济南护理职业学院,山东省济南市,250000
【正文语种】中文
【中图分类】R318
背景：研究表明新西兰兔软骨组织可作为组织工程支架材料，其中关节软骨及耳软骨的脱细胞基质的研究较多，但采用肋软骨作为组织工程软骨支架的研究较少。

目的：制备新西兰兔肋软骨脱细胞基质，探讨天然软骨支架作为组织工程支架的可行性。

方法：用联合去垢剂-酶法获得软骨支架，根据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0，24，48，96 h分为4组。

脱细胞完毕后各组支架固定行扫描电镜采集图像观察计算支架孔隙率、孔径长度，并对支架进行苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，并将脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下观察其相容性。

结果与结论：兔肋软骨脱细胞基质呈乳白色，大小均一，染色示支架结构完整，仍保存大量酸性黏多糖及Ⅱ型胶原成分，扫描电镜观察经一定时间的脱细胞处理后可得到结构完整，孔隙均匀的天然软骨支架，其孔隙率为(61.31±8.45) %；孔径长度为(32.80±5.15) μm，符合正态性分布，各组脱细胞支架植入异体新西兰兔皮下7 d后生物相容性良好，周围软组织无明显充血、化脓等炎症排斥反应出现。

结果显示，兔肋软骨脱细胞支架具有良好的基质组成，有较完整、均匀的孔隙结构及孔径分布，可作为组织工程支架材料。

组织工程研究的3大基本要素是种子细胞、载体材料及生物活性分子[1]。

软骨脱
细胞基质(acellular tissue matrix，ACTM)是一种天然生物支架材料，其性能作用更接近于生物体内自生组织，因其去除了细胞所含抗原性，与种子细胞具有良好的相容性[2]。

目前对于脱细胞真皮、骨组织及瓣膜材料的研究较多，部分研究已经
应用于临床[3]，但脱细胞软骨的研究仍较少。

临床经验证实软骨缺损确实是临床
器官及组织修复的较大障碍，目前尚没有很好的解决方案，软骨的组织工程替代物的研究显得更为迫切。

目前国内有一些研究均利用兔脱细胞软骨构建天然组织工程支架并获得一定成果[4-6]，证实天然脱细胞软骨支架可以作为良好的组织工程支
架材料。

肋软骨属透明软骨，临床上自体肋软骨已被广泛的应用于人体器官组织再造及缺损的填充修复，因肋软骨来源较广泛，取材方便，因此实验以兔肋软骨作为软骨材料来源，进行脱细胞研究。

异体软骨对于生物体仍具有一定的抗原性，实验以兔肋软骨作为研究材料，以联合中性去垢剂-核酸酶法基本脱去其上软骨细胞成分，降低软骨支架抗原性，以提高
支架材料生物相容性。

鉴于此，实验制备软骨组织工程天然生物支架，为应用于临床作为软骨组织替代品修复软骨缺损提供一定的实验依据。

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009-08/2010-07在山东大学附属省立医院中心实验室完成。

材料：健康成年雄性新西兰大白兔12只，清洁级，体质量(2.0～2.5) kg，购自山东省农科院畜牧研究所，动物许可证号为SCXK(鲁) 20040013。

实验方法：
兔肋软骨的分离：新西兰大白兔8只，体积分数3%戊巴比妥钠1 mL/kg耳缘静
脉麻醉后，无菌手术刀切开胸腔，暴露肋软骨，钝性分离双侧第4～7对肋软骨，即刻去除软骨膜，暴露完整软骨组织，生理盐水冲洗数次，4 ℃生理盐水冷藏备用。

脱细胞肋软骨的制备：以无菌手术刀将新鲜肋软骨制成3 mm×2 mm×1 mm大
小组织片，根据脱细胞过程中Triton X-100第2次处理时间0，24，48，96 h
分为4组，每组随机分配2只兔肋软骨组织。

依据文献[4-5]的方法，将兔肋软骨
组织置于含蛋白质阻断剂苯甲基璜酰氟(PMSF，0.35 mmol/L)的低渗及高渗Tris-HCl缓冲液中，先后振荡漂洗24 h；D-Hank’s缓冲液4 ℃洗净后，置于体积分数1% Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液4 ℃漂洗24 h，而后置于1 g/L RnaseA 500 U/mL Dnase Ⅰ混合消化酶液37 ℃振荡漂洗4 h，再次加入体积分数1% Triton X-100低渗Tris-HCl缓冲液4 ℃漂洗，Triton X-100第2次处理
是分别漂洗0，24，48，96 h，最后各组置于D-Hank’s缓冲液4 ℃持续漂洗
后置于-80 ℃低温冰箱冷冻过夜，第2天冻干，于16 mm紫外线灯下20 cm照
射交联24 h，环氧乙烷灭菌后室温保存备用。

各组脱细胞支架体积分数4%中性
甲醛室温固定后制作组织蜡块行组织学苏木精-伊红染色，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶
原免疫组织化学，体积分数2.5%冷戊二醛固定制备扫描电镜样品行扫描电镜观察。

随机选取ACTM若干片，并随机选取多个支架电镜图片孔径100个，通过Image Pro Plus 6.0版图像分析软件计算其孔隙率及孔径长度。

脱细胞肋软骨的生物相容性评价：选取各组脱细胞支架，分别种植于4只健康异
体新西兰兔脊柱两侧皮下，待种植7 d后取出支架行大体观察种植处支架与周围
软组织的相容性。

主要观察指标：软骨脱细胞基质大体形态及组织学变化，脱细胞肋软骨支架的孔隙率及孔径大小变化和生物相容性。

统计学分析：计量资料以±s表示，SPSS 17.0统计软件包对实验数据数据进行正
态性检验，因样本数＜ 2 000，以单一样本KS 检验行正态性检验，P ＞ 0.05为
总体符合近似正态性分布。

2.1 实验动物数量分析实验兔12只均进入结果分析，无脱落。

2.2 软骨脱细胞基质大体形态ACTM大体观察，各组脱细胞软骨支架大小较均等，
同新鲜软骨的黄白色不同，色泽呈乳白色，质地同新鲜弹性软骨，具有一定弹性及脆性。

2.3 软骨脱细胞基质的组织学变化
苏木精-伊红染色结果：见图1。

各组染色结果示随着脱细胞时间延长，各组支架内软骨细胞逐渐被脱去，以
Triton X-100第2次处理96 h效果最为显著，未见蓝染细胞核及胞浆成分，软骨陷窝结构清晰，无明显断裂及破坏，软骨周边无明显断裂及分层。

甲苯胺蓝染色结果：各组ACTM均异染成蓝紫色，表明软骨支架中仍然存在大量
酸性黏多糖成分，作为软骨基质重要部分，为后期与种子细胞复合种植提供载体。

见图2。

Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果：各组ACTM染色均呈现明显棕黄色，且无明显
差异。

随着软骨主要细胞成分脱失，ACTM仍保存有软骨主要基质成分——Ⅱ型
胶原。

见图3。

2.4 扫描电镜观察结果扫描电镜下观察ACTM样品表面结构清晰，随着脱细胞时
间延长，各组残存杂质及细胞逐渐减少，以Triton X-100第2次处理96 h脱细
胞效果最为明显，可见细胞基本全部脱去，软骨陷窝形态饱满，无明显变形。

2.5 脱细胞肋软骨支架的孔隙率及孔径大小变化随机选取的脱细胞软骨支架100
个孔径，其孔隙率为(61.31±8.45)%；孔径长度为(32.80±5.15) μm。

经SPSS 17.0软件做正态性检验：单一样本KS 检验孔隙率P= 0.987 ＞ 0.05，孔径长度
P=0.975 ＞ 0.05，均符合正态性分布。

2.6 生物相容性变化各组支架与异体新西兰兔复合7 d后取出，观察种植处周围
软组织均未发现有充血、化脓及分泌物情况，无肿胀、局部温度增高等炎症反应及局部排斥反应，均未见明显包囊形成。

列入4只新西兰兔均未见感染和死亡情况，各组ACTM的生物相容性良好。

组织工程支架材料一般分为人工合成与天然生物材料，人工合成支架材料对组织来说是异物，具有一定的抗原性，与组织相容性较差，其应用受到一定限制[7]。

脱
细胞基质材料因来源于天然生物活体，具有人工合成材料所无法比拟的优越性，因其去除了导致大部分抗原性的细胞成分，仅残留基本基质成分，种子细胞复合后能为细胞提供良好的类似于体内的生长增殖结构及环境，并与种子细胞可相互影响。

实验采用清洁级新西兰兔初步预实验，提取其同种异体肋软骨，因新西兰兔为近交系物种，具有遗传的均一性及科研结果的可靠性[6-8]，在后期动物实验中能保证
移植物与宿主间较低的免疫排斥反应。

目前国内有多项研究利用兔软骨构建脱细胞基质支架并获得一定成果[4-6]，证实天然脱细胞软骨支架可以作为良好的组织工
程支架材料，但应用较多的是耳软骨(弹性软骨)及关节软骨(透明软骨)[6，9]，应
用肋软骨作为实验材料少有报道，因弹性软骨硬性差，关节软骨来源少，取材不方便，均一定程度上限制了其应用。

本次实验利用兔肋软骨作为实验材料，其来源广泛，取材方便，因其自有的规则的长条形结构，可简易制成软骨组织切片，为实验提供了前提基础。

在实验肋软骨基质脱细胞过程中，在蛋白质阻断剂PMSF的保护下，在低渗与高
渗缓冲液的环境下通过非离子表面活性去垢剂Triton X-100对软骨细胞膜穿透裂
解作用，将软骨细胞充分破坏裂解，在2种核酸酶的最适消化作用下将细胞中核
酸成分彻底消化分解。

结果示各组软骨支架甲苯胺蓝染色均呈蓝紫色，苏木精-伊
红染色及扫描电镜观察均示Triton X-100第2次处理96 h未查见明显细胞成分，细胞已基本全部脱去，支架保留了其基本三维构架的完整性，随着脱细胞时间延长，PMSF防止细胞裂解后释放的各种酶对软骨基质成分的消化，使得支架仍然保留了其基本的Ⅱ型胶原及酸性黏多糖等ECM成分，保证支架拥有较低抗原性及有利于细胞种植和黏附的结构基础，酸性黏多糖保证支架一定的力学结构，一定意义上保存了支架的抗压性。

扫描电镜下观察脱细胞支架拥有较均匀的孔隙率及孔径长度，
较小的孔径长度及较均匀的孔隙率保证细胞接种效率，为其生长提供了较大的附着表面积，其孔隙间较好的维持了相互连通的三维网状结构，对于种子细胞的良好黏附、迁移及增殖、营养物质的交换、代谢产物的及时排出提供了良好的空间基础。

各组支架植入异体新西兰兔皮下7 d后打开移植部位观察周围组织情况，均未见有明显炎症及排异反应，初步证实了脱细胞肋软骨支架良好的生物相容性，可作为新一代的软骨组织工程支架应用于动物实验研究。

实验在进行中根据Triton X-100第2次处理支架时间将支架分为4组，支架处理完毕根据苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色结果动态的分析了支架在各个处理时间下的成分状态，从而证实Triton X-100第2次处理96 h后可完全将软骨支架中细胞成分脱去，而不致影响支架所固有的ECM成分。

以往较少有动态观察支架处理状态的实验文献报道，实验结果可为支架的脱细胞处理提供参考时间值。

兔肋软骨经去垢剂-酶法脱细胞一定时间处理后，可得到具有良好孔隙率、孔径长度及稳定的细胞外基质组成的组织工程支架，可进一步进行组织工程支架与种子细胞的复合研究，为临床器官组织再造及软骨缺损及畸形的修复提供了一定的实验基础，未来可为耳软骨缺损、鼻再造及关节软骨缺损及畸形病患缓解病痛。

但本次实验仅初步证实了ACTM植入生物体的低抗原性，未对其进行长远的动物体内埋置实验及观察，尚不能说明其植入后远期效果，支架与种子细胞的复合仍待进一步研究，复合材料在组织工程的应用仍需远期观察。

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作者贡献：栾保华进行实验设计，实验评估为栾保华、孙良、李中华、王小霞。

实验实施、资料收集和成文为刘萌萌和张健，栾保华审校，栾保华、刘萌萌、张健、孙良、李中华和王小霞对文章负责。

致谢：衷心感谢山东大学附属省立医院中心实验室张捷老师及病理科刘宇老师在本次实验中给予的极大帮助！
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。

伦理批准：实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》[10]。

本文创新点：本实验在支架脱细胞过程中对脱细胞的时间给予量化比较。

目前临床应用软骨修复缺损及畸形大部分均采用自体肋软骨实验采用新西兰兔肋软骨作为实验材料，更贴近于临床，此处亦具有一定的创新性。

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