茶多酚联合反应停对人肺腺癌A549抑制作用研究

茶多酚联合反应停对人肺腺癌A549抑制作用研究1李元青1，2，马成杰1，2，刘朝阳3，陈信义1，2
1北京中医药大学东直门医院肿瘤血液科，北京(100700)
2教育部、北京市重点实验室（中医内科学），北京(100700)
3中国医学科学院肿瘤研究所，北京(100021)
E-mail：chenxinyi0729@
摘要：目的：观察茶多酚联合反应停对人肺腺癌生长的抑制作用；为研究茶多酚抗肿瘤血管生成提供依据。

方法：人源肺腺癌（A549）细胞系经传代培养后，以BALB/c-nu祼鼠进行肿瘤移植，并以茶多酚, 反应停及其联合用药进行干预性治疗，通过观察抑瘤率评价单用及联合用药对A549移植瘤生长抑制作用。

结果：茶多酚、反应停及联合用药组的抑瘤率分别为33%、21.6%和35.9％，茶多酚、联合用药组与模型组相比有统计学意义(P＜0.05)；联合用药组与单用药组比，无统计学意义(P＞0.05)。

结论：茶多酚对A549生长有明显的抑制效果；反应停对A549的抑制作用需进一步观察；两者联合使用未见明显增效作用。

关键词：茶多酚，反应停（沙利度胺），联合用药，人肺腺癌（A549）
反应停(thalidomide,化学名：酞胺哌啶酮)是20世纪50年代末期问世的一种镇静药物，因其有致畸作用而被市场淘汰，近年研究发现反应停具有抗肿瘤血管生成作用和免疫调节作用[1]，在部分临床试验中有一定疗效。

茶多酚是一种通过多途径抑制肿瘤生长的天然药物，新近研究表明[2-7]，茶多酚对肿瘤血管生成也有明显的抑制作用。

为探求新的用药组合，增强临床疗效。

我们在既往茶多酚抗肿瘤血管生成的研究基础上，进行了本次实验，以观察茶多酚联合反应停对人肺腺癌（A549）移植瘤的抑制效果，探讨联合用药是否具有增效作用。

1 材料
1.1 动物与细胞系
BALB/C-nu裸鼠32只，6～8周龄，SPF级，雌雄各半，由中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤医院实验动物室繁育并提供。

动物生产合格证号：京动许字（1999）第015号；动物合格证号:SCXK京2004－0006，在动物实验中心屏蔽系统辅以洁净层流柜环境中饲养。

人肺腺癌（A549）细胞系，由中国医学科学院肿瘤研究所检测中心常规保存并提供。

1.2 药物
茶多酚系江西绿康天然产物有限责任公司惠赠，纯度98%, 纯度98%。

反应停由常州制药厂生产，产品批号：0603231。

1.3 仪器
超净工作台系苏州宏瑞净化科技有限公司生产(型号SCW-CJ)；实验用离心机系江苏恒瑞制药机械有限公司生产(型号LS150)；倒置显微镜系日本NIKON株式会社生产(型号TS100)；游标卡尺系中国杭州工具量具有限公司生产(型号HGL-18-1)；奥豪斯电子精密天平系美国OHAUS公司产品（型号ARA520）；Forma恒温培养箱为美国Forma公司产品（型号3111）。

1本课题得到国家自然科学基金（编号：30472280）的资助。

2. 方法
2.1 细胞培养与接种
A549细胞系用含10%小牛血清的DMEM培养液培养,细胞长满单层后用0.25%胰蛋白酶消化,培养液吹打、离心，收集细胞用PSB稀释，浓度调至1×107个细胞/ml，每只小鼠以0.2ml接种于右腋皮下，待肿瘤长至体积约为1000mm3时移植。

2.2 造模及分组
选择生长良好、瘤结无破溃的荷瘤裸鼠，拉断颈椎处死，在净化工作台内，无菌条件下完整剥离瘤结，用生理盐水洗去血渍，剪开瘤结，清除中心坏死组织，充分匀浆制备瘤细胞悬液，加生理盐水稀释细胞数至1×107个细胞/mL。

取0.2ml/只，接种于裸鼠右腋窝皮下，接种在30min内完成。

10天后肿瘤体积约在100-300mm3之间（32只裸鼠造模全部成功）时，根据性别分层，按肿瘤体积大小随机分为模型对照，茶多酚，反应停、茶多酚加反应停4组，每组8只，称体重标号。

2.3 给药剂量与方法
给药剂量均采用人与动物剂量换算法确定。

①模型对照组，生理盐水每天0.2ml/10g灌胃；②茶多酚干预组，茶多酚按112.5mg/kg/d（成人治疗量900mg/70kg/d换算）给药，生理盐水配置浓度为5.625 mg/ml，每天0.2ml/10g灌胃；③反应停组，反应停按76 mg/kg/d（成人常用治疗量600mg/70kg/d换算）给药，生理盐水配制成浓度3.8mg/ml，每天0.2ml/10g 灌胃。

④茶多酚加反应停组，两药的给药剂量与单用药组相同，为保证灌胃体积的一致性，茶多酚配制浓度为11.25mg/ml；反应停配制浓度为7.6mg/ml，每天各0.1ml/10g灌胃。

分组当天开始给药，每天一次，连续14天。

2.4 计算方法
药物处理前、后每4天用毫米游标卡尺测量肿瘤长、宽最大垂直直径。

按如下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm3）=肿瘤长径×肿瘤短径2/2。

用药结束后2天处死裸鼠，取出肿瘤，称重。

按如下公式计算肿瘤抑制率：抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重）/对照组平均瘤重×100%。

2.5 统计方法
x±表采用SPSS13.0统计软件进行数据处理。

干预治疗前后小鼠体重以及肿瘤体积以s 示，并采用t检验，组间比较采用F检验，当p<0.05时被认为有统计学意义；肿瘤抑制率以百分率表示。

3. 结果
3.1 一般情况
实验前各组裸鼠一般状态良好；实验中各组祼鼠觅食、饮水、活动等状况良好，未发现脱毛、腹泻等现象；实验结束时32只动物全部存活，无明显异常现象。

3.2 肿瘤体积变化
从分组用药开始到实验结束，移植瘤体积变化见表1。

x±)
表1. 实验各组肿瘤体积的动态变化(s
肿瘤体积mm3
时间
模型对照组 茶多酚干预组 反应停干预组 茶多酚加反应停组 第0天 161.71±26.38 158.08±30.50 163.86±37.55 181.49±38.12
第4天 388.89±57.86 187.62±32.22**324.62±64.25*292.14±57.83**
第8天 766.10±186.29 325.82±60.06**549.76±106.57*471.06±148.55**
第12天 1258.77±321.32 726.20±139.87**979.08±251.30*768.61±162.11**
第16天 1793.68±483.06 1198.31±279.24**1390.44±366.37*1182.96±198.24**
与模型组比*P＜0.05；**P＜0.01
从表1可以看出，从用药后第4天开始，三个用药干预组肿瘤体积均小于模型组，有统计学意义（反应停为P＜0.05，茶多酚与联合用药组P＜0.01）；但联合用药组与单用药组之间肿瘤体积差异不大，无统计学意义（P＞0.05）。

3.3 肿瘤抑制率
茶多酚、联合用药组的抑瘤率分别为33.0%、35.9%，与模型组比有统计学意义（P＜0.05）；反应停的抑瘤率为21.6%，与模型组比无统计学意义（P＞0.05）；联合用药组与单用药组比无统计学意义（P＞0.05）。

x±）
表2.实验各组肿瘤重量与抑瘤率（s
分 组 N 瘤重g 肿瘤抑制率(%)
模型对照组 8 1.58±0.46 ——
茶多酚干预组 8 1.06±0.34*33.0
反应停干预组 8 1.24±0.58 21.6
茶多酚加反应停组 8 1.01±0.20*35.9
与模型组比*P＜0.05
4. 讨论
自70 年代初Folkman 等[8]首先提出肿瘤生长依赖于新生血管生成以来，血管生成抑制剂在肿瘤治疗方面的研究日趋活跃。

1994年D’Amato 等[1]发现口服反应停能够显著抑制成纤细胞生长因子(bFGF) 诱导的兔角膜血管生成，推测反应停致畸作用可能因为抑制了胎儿发育过程中的肢芽血管生成所致。

随后的研究[9、10]证实反应停通过抑制肿瘤血管生成来达到抗肿瘤的作用。

相对于新研制的抗肿瘤血管生成药物而言，反应停较为经济，目前已用于多种肿瘤的临床治疗，成为老药新用的典型代表。

但用于抗血管生成治疗，反应停需长期使用，出现副作用相对较多，除常见的嗜睡、疲倦、便秘等副作用外，也可见周围神经病、深静脉血栓、中毒性表皮坏死溶解症等较重副作用，严重影响临床应用[11]。

如果能采取有效的方法增强其疗效，减轻其副作用，会产生很好的临床效果及经济效益。

茶多酚则是公认的有抗癌作用的天然药物，研究表明茶多酚可通过多种途径对肿瘤形成产生影响，包括抑制肿瘤细胞生长、抗突变、诱导肿瘤细胞凋亡与分化；以及新近的研究[2-7]证实茶多酚可以通过下调VEGF、上调TIMP-2的表达，抑制肿瘤微血管的生成。

反应停与茶多酚有着共同的抗肿瘤血
管生成的作用，但有不同的作用机制，我们推测两者联合用药可能有一定的增强抗肿瘤血管生成的作用，会对临床应用有所裨益。

本实验结果表明，与模型组比，茶多酚对移植性人肺腺癌（A549）有很好的抑制作用（P＜0.05）。

这与我们的前期研究结果相近，即茶多酚对移植性S180及乳腺癌EMT6小鼠肿瘤均有明显抑制作用[6、7]。

反应停组与模型组在肿瘤体积上有统计学差异（P＜0.05），而抑瘤率无统计学差异（P＞0.05）。

分析的可能原因为，①本实验用药是按临床成人常用量600mg/70kg/d折算成小鼠实验用量为76mg/kg，与报道常用100～200mg/kg小鼠实验用量相比，剂量偏低所致；②反应停服用的时间周期较短，抑制肿瘤的作用未充分发挥；③反应停的抗血管生成作用有种属特异性[12]，有研究表明单剂反应停对家兔有血管生成抑制作用,而对小鼠没此作用；④反应停的抗血管生成作用可能有组织特异性，Belo等[13]的实验证实，反应停对小鼠血管生成的抑制作用，但未发现反应停对同种系小鼠所荷Ehrlich瘤有抑制作用。

从统计学角度分析，联合用药对移植人肺腺癌A549的抑制作用并不比单独用药占优势（P＞0.05），但就抑瘤率来说联合用药比单独用药要高。

这也表明反应停与茶多酚联合用药有进一步研究的价值，需要我们改进方法，完善实验方案，进行深入研究。

在此基础上，可通过检测与反应停密切相关的抗血管生成因子，进一步对茶多酚抗肿瘤血管生成机制进行比较研究。

参考文献
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growth in mice [J]. Inflammation, 2001, 25 (2):91 - 96.
The Combination of Tea polyphenols and thalidomide
inhibits xenografted tumor growth of human Lung
Adenocarcinoma A549
Li YuanQing1，2，Ma ChengJie1，2，Liu Chaoyang3，Chen XinYi1，2
1Department of Oncology and Hematology，Dongzhimen Hospital，affiliated with the Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing（100700）.
2Key Laboratory of the Ministry of Education and the Beijing Municipality，Chinese Internal
Medicine Laboratory，Beijing（100700）
3Cancer institute Chinese Academy Of Medical Sciences，Beijing（100021）
Abstract
OBJECTION: To observe the suppression of human lung adenocancer growth to tea polyphenols plus thalidomide. To seek drug combination better curative effect. To offer the foundation which tea polyphenols inhibit angiogenesis effect and research its molecular mechanism. METHODS:After cultured and propagation, human lung adenocancer of A549 was implanted on BALB/c nude mice. Tea polyphenols, thalidomide and drug combination were taken by peroral administration. Antitumor function was determined with regular methods. RESULTS: The tumor control rate of tea polyphenols group, thalidomide group and drug combination group were respectively 33%, 21.6% and 35.9％. The average tumor weight of tea polyphenols and drug combination groups were smaller than that of model group(P＜0.05). The average tumor weight had no significant difference between thalidomide group and model group. The average tumor weight of drug combination was no smaller than that of tea polyphenols group and thalidomide group(P＞0.05). CONCLUSION: Tea polyphenols and drug combination had significant inhibition effect on human lung adenocancer, but drug combination had no significant inhibition effect.
Keywords：Tea polyphenols， thalidomide，drug combination，human lung adenocancer of A549
作者简介：
李元青，1975年生，女，北京中医药大学在读博士。

研究方向：中西医结合治疗肿瘤研究；陈信义，1954年生，男，教授。