干样试验方法

准备：5毫升移液器,1毫升移液器1、脯氨酸含量的测定
原理：
当用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，不仅大大减少了其
他氨基酸的干扰，快速简便，而且不受样品状态（干或鲜样）限制。

在酸性加热条件下，脯
氨酸与苗三酮反应生成稳定的红色缩合物，再用甲苯萃取，此缩合物在520nm波长有一最
大吸收峰。

脯氨酸含量的高低在一定范围内与其消光度成正比。

从标准曲线上查出（或用回
归方程计算）脯氨酸的含量。

步骤：
1、脯氨酸提取：称取干样0.05g（精确记录样品质量）放入13毫升带盖离心管中，加10ml超纯水，将管口套上封口袋（用油性记号笔标记管内溶液高度）,加盖后沸水浴提取60min,冷却后静止大约三个小时，放置冰箱保鲜层静止过夜，用超纯水补充蒸发水分（根据记号笔
做的记号）,最后吸取上清液到另一13毫升带盖离心管中，保存上清液用于测|定月甫氨酸,
总氨基酸，游离阳离子（Na、K、Ca、Mg、Fe）,NO3一,Cl；H2PO4；SO4”,可溶糖。

没测完一个指标后，提取液要放在水浴锅100度5分钟
灭菌，然后冻在冰箱中
2、脯氨酸含量测定：取1ml提取液+1ml3%磺基水杨酸+1ml冰醋酸+2ml2.5%酸性苗三酮加入玻璃试管中沸
水浴显色反应60min,冷却至室温后向其加入4ml甲苯
振荡萃取红色物质，静止后用吸管或5毫升移液器吸取红色液体比色.o
注意：每次比色时，都要用无水乙醇或甲苯将比色皿和吸管清洗，如果用5毫升移液器
吸取红色液体比色，则用准备很多枪头就可以了。

药品配制：
1、3%磺基水杨酸例如配置500ml,即将15g磺基水杨酸溶于500ml超纯水中。

2、2.5%酸性苛三酮显色液冰乙酸和6mol/L的磷酸以3:2混合作为溶剂进行配置。

即若
配置250ml2.5%的酸性苗三酮的话，所需试剂为：6.25g苛三酮；150ml冰乙酸；100ml6mol/L磷酸（40.8ml 浓磷酸加59.2ml超纯水中）注意事项：
1、磺基水杨酸需现用现配（24小时内失效）
2、酸性苛三酮：于70c加热溶液，冷却后置棕色试剂瓶中，4c下保存备用，2-3天内有效。

含量计算：
根据已有标准曲线计算含量：脯氨酸含量（师ol/g.DW）=（OD值-0.00208）*1000/（3.07*样品质量*115）
也可自行做标准曲线:脯氨酸标准曲线制作
脯氨酸标准液的配制：
（1）在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量超纯水溶解，然后
倒入250ml容量瓶中，加蒸储水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100ug。

（2）系列脯氨酸浓度的配制。

取5个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、
5.0ml,用蒸储水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为2ug/ml、4ug/ml、6ug/ml、8ug/ml、10ug/ml。

取2ml一系列浓度（0、2、4、6、8、10ug/ml）的脯氨酸标准液分别加入1ml3%磺基
水杨酸+1ml冰醋酸+2ml2.5%酸性苛三酮，置沸水浴中显色反应60min。

冷却至室温后向其加入4ml甲苯，振荡萃取红色物质，静止后取上层甲苯层，于520nm处测定OD值。

以脯氨酸浓度为X,以OD520为丫，绘出标准曲线或计算出脯氨酸浓度与OD520之
间的线性回归方程。

2、可溶糖含量的测定原理：
本试验采用意酮比色法测定可溶性糖含量。

糖在H2SO4作用下生成糠醛，糠醛再与慈酮作
用生成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。

在625nm波长下的OD值与糖含量呈正比。

由于慈酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。

因
此可利用该性质来测定植物组织中可溶性总糖的含量。

步骤：
2、可溶糖含量测定：水提取液0.2毫升+0.8毫升无水乙醇+慈酮试剂3ml,90c
下保温15min,冷却后于620nm处比色。

所需试剂及配置：
1、慈酮试剂：150mg慈酮溶于100ml76%的稀硫酸中。

2、76%的稀硫酸：76ml浓硫酸加到30ml超纯水中。

注意事项：
意酮试剂应现用现配并保存于棕色试剂瓶中。

配制硫酸溶液：准备2000毫升大
烧杯，先向其中加入所需水量，然后再缓缓向水中加入浓硫酸，切记！！
含量计算：
可溶糖含量（师ol/g.DW）=（吸光值-0.0352）*1000/（0.21*样品质量*342）
3,游离Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Fe2+等阳离子和阴离子测定
将上述水提取液稀释若干倍（通过预实验确定），直接用原子吸收分光光度计测定阳离子。

用师大离子色谱测定阴离子（NO3；Cl=H2P。

4;SO42）含量
4矿质元素含量的测定
4.1总氮含量测定
用凯氏定氮方法。

称取0.1克干样，消化，然后滴定。

可查阅试验指导。

消化液还可以稀释若干倍后测定CaMgFe、M R Zn等金属元素含量(用原子吸收分光光度计)。

4.2金属元素含量测定(另一消化方法)
提取方法：H2SO4-H2O2-HCIO4消煮法：准确称取干样品0.1g,放入凯氏烧瓶底部，加入
3ml浓H2SO4和几粒玻璃球。

放在表面温度为500c的电热板上炭化或油浴(与凯氏定氮消化方法相同)约15分钟取下，放在石棉垫上冷却至约100C,加入1ml30%的H2O2,摇转后再在电热板上消煮，待H2O2蒸完后再冷至约100C,再加1mlH2O2消煮，蒸去H2O2后稍冷，添加1ml60%HClO4,继续消煮至清亮为止。

冷至室温后将消化液移入25ml容量瓶中用去离子水定溶，即为待测液，注意定容的时候将消化管中的粘有的消化液反复洗出，减少误差。

注意如果用凯氏定氮消化瓶消化样品，则上述H2SO4-H2O2-HCQ4用量可加倍.
测定方法：Ca、Mg、Fe、Mn、Zn,Cu用原子吸收光谱仪测定。

P元素用铝蓝比色法测定。

含量计算：
元素含量(mmol/g.DW)=测定值(ug/ml)*稀释倍数*提取液总体积(ml)/[分子量(g/mol)*
取样量(g)*1000]
4.3P元素测定
铝蓝比色法：
原理：在酸性条件下，无机磷可与铝酸钱作用生成磷铝酸钱，并被还原型Vc还原成亮蓝色的铝蓝络合物，由颜色的深浅即可测定磷的含量。

试验步骤：取消煮待测液0.4ml+5ml铝酸氨-硫酸混合溶液+2毫升3%Vc沸水浴中反应15分钟，于700nm处比色所需试剂及配置：
1、铝酸钱-硫酸混合溶液：称取25g铝酸钱于大烧杯中，加入200ml去离子水溶解。

将280ml浓硫酸慢慢倒入400ml去离子水中，冷却。

然后把上述配好的铝酸钱溶液加入此硫酸溶液中并用去离子水稀释至1L。

2、3%Vc溶液(质量/体积)
P含量计算：
P含量(gol/g.DW)=[(721.79*吸光值-3.1077)*稀释彳数*提取液总体积(ml)]/[分子量*样品质
量(g)*].
5,总氨基酸含量测定提取方法同脯氨酸取0.25ml水提取液加入3ml苛三酮试剂，再加入0.1ml抗坏血酸。

沸水浴15min,冷却后
于530nm处比色测吸光值（OD。

计算公式如下：氨基酸含量（mol/gDW）=（吸光值
-0.0068）*10*1000/（13038*样品质量）药品配制
苛酸酮试剂：1.2g重结晶的苛三酮，加入15ml正丙醇，摇匀，使之溶解，后加入30ml正丁醇和60ml乙二醇，混匀。

再加9mlpH5.4的醋酸缓冲液，混匀。

保存于棕色瓶中，置冷凉处，适用期限10天；
1%C坏血酸配制方法：1g加入100ml纯水中。

6,甘露醇含量测定
甘露醇含量测定方法：取0.5ml水提取液，加入0.5ml超纯水，再加入1ml高碘酸钠（室温
静置10min）。

再加入2ml鼠李糖，混合后再4ml新鲜配制的Nash试剂,53C水浴加热15min使其显色，冷
却后于413nm处比色，测吸光值。

甘露醇含量（叩ol/g.DW=（吸光值-0.0036）*1000/（10.4*40*样品质量*182.17）
药品配制
高碘酸钾溶液的配制方法：0.3207g高碘酸钠+0.12mol/L盐酸100ml,配制成100ml的高碘
酸钾溶液。

鼠李糖溶液的配制方法：0.1002g鼠李糖定容到100ml。

Nash溶液的配制方法：15g乙酸镂+0.2ml冰乙酸+0.2毫升乙酰丙酮定容至100ml.
7,20种游离氨基酸含量：
最后测定：
用水提取液，用氨基酸分析仪测定。

8根活力测定
药品配制：0.4%TTC,0.4克TTC溶于100毫升蒸储水中，遮光保存
十五分之一磷酸缓冲液配制参考试验指导测定：1.取新鲜根0.5克左右，放入试管中，向其中加入5毫升0.4%TTC,5毫开磷酸缓冲液，37度遮光反应1个小时。

然后向其中加入2毫升1mol/L硫酸终止反应。

2.将根捞出，用滤纸吸干，放入13毫升带盖离心管中，向其中加入10毫升乙酸乙酯，黑暗侵泡1-2天，待根变白。

3取2中红色溶液485nm比色4标准曲线配制：取0.4%TTC0.2毫升+9.8毫升乙酸乙酯，向中加少量Na2S2O4反应生成TTF（反应产物）母液，TTF浓度80ug/ml。

然后用乙酸乙酯将其稀释成0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6倍，485nm比色，
建立吸光值与TTF浓度之间的方程，然后计算根活。