家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性的测定

家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性的测定
甘丽萍;刘仁华;李彦杰;钟彦
【摘要】为了调查家蚕幼虫总蛋白酶和胰蛋白酶活性,并探讨与丝氨酸蛋白酶基因表达之间的关系.对家蚕不同组织、不同时期、不同品种来源的样品进行了总蛋白酶和胰蛋白酶活性的检测.在Ysh品种中肠中的总蛋白酶和胰蛋白酶活性都高于丝腺,性别差异不显著,品种中Dazao和Ysh显著高于Y-1和C108;Ysh品种5龄3日中肠中的胰蛋白酶活性显著高于5龄7日,高浓度蜕皮激素(20E)处理后24h中肠中胰蛋白酶活性下降幅度比较大,保幼激素处理后变化不显著.胰蛋白酶活性测定结果与SPs家族基因特异性的在中肠表达,5龄中期表达高于5龄末期,20E处理后24h出现下调表达的结果是一致的;不同品种酶活性的差异可能与生命力差异有关.为家蚕丝物质形成和积累提供了分子调控的参考依据.
【期刊名称】《西南农业学报》
【年(卷),期】2015(028)004
【总页数】4页(P1847-1850)
【关键词】家蚕;总蛋白酶;胰蛋白酶;丝氨酸蛋白酶家族
【作者】甘丽萍;刘仁华;李彦杰;钟彦
【作者单位】重庆三峡学院生命科学学院,重庆万州404000;重庆三峡学院生命科学学院,重庆万州404000;重庆三峡学院生命科学学院,重庆万州404000;重庆三峡学院生命科学学院,重庆万州404000
【正文语种】中文
【中图分类】S884
丝氨酸蛋白酶家族(serine proteinases，SPs)SPs是以丝氨酸为活性中心的一类酶，包括弹性蛋白酶(Elastase)、胰蛋白酶(Trypsin)、枯草溶菌酶(Antalzyme)、蚓激
酶(Lumbrukinase)等[1～2]。

许多昆虫物种的SPs主要是胰蛋白酶，鳞翅目昆虫
幼虫的中肠中，SPs在蛋白水解过程中发挥作用[3]。

家蚕有其物种特异性的SPs，目前在家蚕中已经鉴定出了143个SPs和SPHs基因，而中肠是表达最高的组织[4]。

丝氨酸蛋白酶前体基因(serine protease precurso，Spp)和类胰凝乳蛋白酶基因(chymotrypsin-like serine protease，Ctlp))主要在家蚕幼虫的中肠中表达，而且在检测的时间点都有表达，眠期有下降趋势。

中肠主要是对桑叶等食物中的蛋白质进行消化吸收和转运的场所，暗示这2个基因的酶蛋白质产物，可能受食物
蛋白质的瞬时激活，参与食物消化吸收[5]。

Western blotting的检测发现，SPP
蛋白也特异性的出现在中肠中。

SPP酶活性被糜蛋白酶抑制素(chymostatin)和苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sμlfonyl fluoride，PMSF)强烈地抑制，表明SPP 酶是一种胰凝乳蛋白酶类似的SP(Trypsin-like serine protease)[6]。

它们在合成之初是酶原失活前体，在转录过程中通过限制性蛋白水解进行剪切后转换成了有活性的形式。

在生物体内，SPs完成催化反应的使命后，激活的SPs需要迅速地被屏蔽功能，
从循环中移除。

Serpins中的许多成员通过抑制SPs的同功酶来参与SPs的活性
调控，保持体内环境的平衡[7]。

了解它们之间的互做关系，对了解蚕体内代谢平
衡有着重要的价值。

依据我们已构建的黄茧限性品种幼虫雌雄SAGE文库中[8]，
对一些SPs基因的时序性表达和组织差异性已经进行了详细的调查，本研究对不
同时期、不同组织、不同品种来源的家蚕样品进行了总蛋白酶和胰蛋白酶活性的检测，来探明与基因表达水平之间的关系，将有助于更好地理解家蚕丝物质形成和积累的调控机理。

1.1 实验材料
供试家蚕品种为限性黄茧品种Ysh，Dazao(绿茧品种)，Y12-1BJ(黄茧品种，简称Y-1)，C108(白茧品种)常规桑叶育。

在4龄眠期，5龄3日和5龄7日分别取材。

激素处理组:①MH处理:在5龄第3日，每条幼虫注射10μg(5μl)的20E溶液。

②JHA处理:在每条幼虫的背中线处涂抹15μl(Methoprene)溶液。

都设对照。

处
理后24 h取材。

1.2 试剂
20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone，20E)，纯度99.6%，保幼激素类似物Methoprene由日本大冢化学株式会社馈赠，原液浓度1.25μg/μl。

Azocasein，Nα-benzoyl-L-arginine p-nitroanilide(BApNA)，N-succinyl-ala-ala-prophenylalanine p-nitroanilide(SAAP FpNA)，phenylmethyl sμlfonyl fluoride(PMSF)，Nα-ptosyl-L-lysine chloromethyl ketone(TLCK)，N-tosyl-L phenyl alanine chloromethyl ketone(TPCK)购自Sigma公司，碧云天BCA试
剂盒。

1.3 总蛋白提取及浓度测定
分别取上述家蚕品种幼虫的中肠和丝腺组织。

加入预冷的PBS(pH 7.4)，在冰浴中用手工或匀浆器将标本匀浆充分。

12 000 r/min离心5 min。

仔细收集上清。

分
装后一份采用碧云天BCA试剂盒检测蛋白浓度，其余冷冻备用。

1.4 总蛋白酶活性的测定
总蛋白酶活性测定使用偶氮酪蛋白(azocasein)作为底物，反应混合物中包括30μl 组织上清液，，30μl 2%azocasein，30μl Glycine-NaOH缓冲液(pH10)，于30°C反应60 min然后加入等体积10 %三氯乙酸，混匀在冰上保持10 min后，上清液与等体积1μg/L NaOH混匀，420 nm测定吸光值。

重复3～4次[9]。

在30℃下每1 min水解酪蛋白产生1 mg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。

1.5 胰蛋白酶活性测定
BApNA作为底物用来测定胰蛋白酶(Li et al.，2004)。

-25℃储存的BApNA(50 mg/mL in DMSO)、用100 mmol/L Glycine-NaOH缓冲液(pH 10)稀释成1.0 mg/mL，20μl酶液加入到180μl底物溶液中，30℃条件下405 nm处(消光系数8700 M)。

酶活性单位定义为:30℃时1min转化1 μmol/L的底物所需要的酶量为一个酶活力单位。

胰蛋白酶活性=(OD2-OD1)/8700×N×[1/(c× t)]/Cprot，其中，OD1指初始时间的吸光度;OD2指终止时间点的吸光度;N指反应液总体积(mL);c指比色光经;t反应时间;Cprot指酶液的蛋白质质量浓度(mg/mL)。

试验数据用±s表示，采用ANVOA (one way)和Student’s-Newman-Keμls post hoc tests (SPSSⅠnc.，Chicago，Ⅰllinois，USA)分析和比较各样品溶液中胰蛋白酶活性差异显著性，P＜0.05为差异显著。

2.1 总蛋白酶活性的测定
在Ysh品种中，在调查的4个时间点，中肠中的总蛋白酶活性基本上一致，雌性在5龄末期有比较明显的下降(图1A)。

雄性丝腺中的总蛋白酶活性总体上高于雌性，在4龄眠期达到了显著，而在雌性中在5龄末期有上升(图1B)。

从组织差异来看，中肠都高于丝腺，并且前3个时间点都达到了显著性(图1C)。

同一个时间点(4龄2日)几个品种的中肠组织中的总蛋白酶活性调查表明，Dazao和Ysh显著高于Y-1和C108(图1D)。

2.2 胰蛋白酶活性的测定
胰蛋白酶活性的调查结果表明，中肠中显著高于丝腺(图2A)。

因此后面几组处理的调查都在中肠中进行。

Ysh蚕品种5龄3日中肠中的胰蛋白酶活性显著高于5龄7日，但性别间差异不显著(图2B)。

不同品种来看，在5龄3日Dazao品种中的胰蛋白酶活性显著高于Y-1和C108，Ysh种也显著高于Y-1。

到了5龄7日，4个品种中胰蛋白酶活性都有下降，Dazao和Ysh下降最为明显。

C108下降不明
显，且高于其他3个品种，显著高于Y-1(图2C)。

激素处理后24 h的中肠样品中胰蛋白酶活性的调查发现，与对照相比，蜕皮激素处理后24 h的Ysh幼虫中肠中胰蛋白酶活性下降幅度比较大，保幼激素处理后变化不显著(图2D)。

3.1 胰蛋白酶活性与其基因时空表达特性一致
Ysh品种幼虫中肠组织的胰蛋白酶活性显著高于丝腺，而中肠中胰蛋白酶活性在5龄3日显著地高于5龄7日，这与SPs家族基因特异性的在中肠表达，并且5龄中期表达高于5龄末期的结果是一致的[5]。

从4龄初期到5龄末期总蛋白酶活性在中肠中略有下降，而在丝腺中有升高趋势。

一个合理的解释是吐丝前中肠中的丝蛋白大量地转运到了丝腺中，在丝腺中积累达到了高峰，而总蛋白酶活性也相应地升高。

在蜕皮激素处理后24 h，中肠中胰蛋白酶活性出现了下降。

这与SPs家族基因在20E处理后24 h表达量出现下调一致。

而保幼激素处理后，中肠中胰蛋白酶活性变化不显著，可能与调查时间有关，因为基因是在处理后48 h出现了比较明显的上升。

Ysh性别之间胰蛋白酶活性的差异不显著，mRNA水平上的差异与酶活性之间没有很严格的同步性。

3.2 不同品种酶活性的差异可能与生命力差异有关
不同蚕品种中总蛋白酶活性和胰蛋白酶活性差异基本一致，Dazao品种在4龄2日的总蛋白酶活性和5龄3日的胰蛋白酶活性都高于其他品种。

到了5龄后期，Dazao品种和Ysh品种中肠中的胰蛋白酶活性显著下降，C108品种的胰蛋白酶活性却有增高的趋势。

从发育时期来看，Dazao品种在5龄后期生长变慢;Ysh品种在吐丝之前生命力也有下降，在化蛹过程中容易死亡，这种现象推测与此时这两个蚕品种中肠中的胰蛋白酶活性低有一定关系。

【相关文献】
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