微生物的生长与环境条件
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• 同步培养法是：能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养
方法叫同步培养法synchronous culture。
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• 机械法又称选择法 • 微生物的子细胞与成熟细胞，通过机械法就可使它们在一定程度上分开
来。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 • 离心沉降分离法 • 过滤分离法
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一、纯培养技术
• 获得纯培养的方法
• 稀释倒平板法 pour plate method
• 涂布平板法 spread plate method • 平板划线分离法 streak plate method
平行划线 扇形划线 其他形式的连续划线
• 稀释摇管法 dilution shake culture method
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二、微生物生长量的测定
• 测定单细胞微生物的数量
• 测定总菌数total count
• 计数板直接测数 • 比浊法
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测定微生物的活菌数viable count 稀释平板测数法dilute plate count 以CFU(colony forming units)表示
x2 = 108
x1 = 104
lg(x2 /x1 ) = lg108 ~ lg104 = 8 - 4 = 4
代入上式 G = 240/3.3 × 4 = 240/13.2 = 18 min
• 即在上述培养液中，世代时间为 18 min。
• 细菌繁殖代数 n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 繁代。
• 不同的生长期理化因子对微生物的影响了可能不同。一般来说， 对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。
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四、连续生长
• 当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产 物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能 长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养continuous culture， 即在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地 加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样 就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物 长期处于旺盛生长阶段。
位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等， 它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。
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三、细菌纯培养的生长
• 以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生长，最后一 次收获，此称分批培养(batch culture)。
稳定期 对数期 滞留期
衰亡期
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• 必须根据待试微生物的形态、生理性状来选择适当的方法。
• 同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生 长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2~3个世代，又逐渐转变 为随机生长，即非同步化。
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第二节 真菌的生长
一、菌丝的生长繁殖
菌丝生长与营养有关。营养丰富，分支多而密，营养贫乏 ，分支少而稀。
生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生物 一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好 可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自 然条件相类似。
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五、同步培养
• 在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如 果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不 符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了 解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个 体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。
也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、 羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同
步化均有作用。
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• 总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多， 应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解 很少，化学诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。
•稀释培养测数法（又称最大概率法，MPN most probable
number）
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• 细胞生物量测定
①细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。 ②总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的
含量。
③DNA含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中DNA含量。 ④代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单
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• 并不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长 的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐 渐下降的曲线。
• 认识和掌握细菌生长曲线，对指导发酵生产具有很大作用： • 计算生长速率和代时；
• 不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解了这些， 就能根据需要进取样和收获；
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• 利用选择培养基分离法 根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：
①分离真菌用马丁氏培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号，pH中 性偏碱。
②不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌，培养基中加10%酚， 抑制细菌、真菌；从土壤中分离真菌，加孟加拉红，抑制细 菌生长。
③根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基 以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基。
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• 恒浊连续培养 • 不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连
续培养。
• 由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜Байду номын сангаас养液流入 和旧培养流出速度，使容器内菌液浓度恒定。
• 工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。
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• 恒化培养 • 控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，
• 如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围 时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。
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第一节 纯培养微生物群体的生长
• 微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物， 必须把研究对象从混杂群体中分离出来。
• 微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得 到的后代称为纯培养pure culture。
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④衰亡期(decline phase) • 细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负
生长”。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称 之为“对数死亡阶段”。 • 这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物， 如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多 种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡， 革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。
• 硝酸纤维薄膜法 • 机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的
生命活必然较为正常。但此法有其局限性，有些微生物即使在相同的 发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采 用这类方法。
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• 调整生理条件的同步法（诱导法）
• 温度调整法 将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时 间，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培 养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分 裂。
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• 在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即 20 →2
1 →22 →23 ……2n
• 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌 繁殖n代产生2n 个细菌。
• 如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数期后期t2 的菌数为 x2，则代时（Generation time，G）（即每增加一代所 需要的时间）应为：
• 营养条件调整法 即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。 例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而 获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同 步生长。
• 用最高稳定期的培养物接种
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• 抑制DNA合成法 • 利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，
• 例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 104 /ml，经过培养 4
h后，又测得菌液中的细菌数为 108 /ml，求此菌的世代时间和在
此时间内繁殖的代数。
• 根据公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
t2 - t1 = （4 - 0）× 60 min = 240 min
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• 在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加（菌丝细胞的 不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只 有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做 繁殖。
• 在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进 行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程 就是发育development。
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• 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等， 大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就 应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；
• 这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的 大量形成也在此时期。
• 从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的 积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在 着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数。
• G=（t2 - t1）/n
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先求代数n
由于x2 = x1·2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2 - lgx1）/lg2
n = 3.3 ·lg (x2 /x1 )
即G =（t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
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关于微生物的生长与环境条 件
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• 微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自 己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则 细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单 地说，生长growth就是有机体的细胞组分与结构在量方面的 增加。
• 单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细 胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形式两个基本相的子 细胞。这种由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖 reproduction。
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③稳定期(stationary phase)
• 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老 细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速 度，又逐渐趋向零。
• 在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生 长呢?
• 这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一 系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸 如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高 速度进行生长和分裂。
又叫恒组成连续培养。这样，细菌的生长速率将取决于限制性因 子的浓度。 • 恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲， 它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生 理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤 其是DNA、RNA及蛋白质合成的变化；同时它也是研究自然条件下微
①延滞期lag phase （滞留适应期）
• 菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调 节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加了但细胞个体体积增大， 代谢活跃。
②对数期logarithmic growth phase
• 细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指 数级数增加，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是 研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用 对数期细胞作为扩大培养的种子液。
方法叫同步培养法synchronous culture。
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• 机械法又称选择法 • 微生物的子细胞与成熟细胞，通过机械法就可使它们在一定程度上分开
来。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。 • 离心沉降分离法 • 过滤分离法
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一、纯培养技术
• 获得纯培养的方法
• 稀释倒平板法 pour plate method
• 涂布平板法 spread plate method • 平板划线分离法 streak plate method
平行划线 扇形划线 其他形式的连续划线
• 稀释摇管法 dilution shake culture method
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二、微生物生长量的测定
• 测定单细胞微生物的数量
• 测定总菌数total count
• 计数板直接测数 • 比浊法
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测定微生物的活菌数viable count 稀释平板测数法dilute plate count 以CFU(colony forming units)表示
x2 = 108
x1 = 104
lg(x2 /x1 ) = lg108 ~ lg104 = 8 - 4 = 4
代入上式 G = 240/3.3 × 4 = 240/13.2 = 18 min
• 即在上述培养液中，世代时间为 18 min。
• 细菌繁殖代数 n = (t2 - t1)/G = 240/18 = 13.3 繁代。
• 不同的生长期理化因子对微生物的影响了可能不同。一般来说， 对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。
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四、连续生长
• 当微生物在一个固定的容器中生长时，由于养料的消耗，代谢产 物的积累，必然会导致微生物生长速度减慢，为了保持微生物能 长时期的处于对数生长期，就要采用连续培养continuous culture， 即在一个恒定容积的流动系统中，一方面以一定的速度不断地 加入新的培养基，另一方面又以相同的速度流出培养物，这样 就可以使容器中微生物的数量和营养状态保持恒定，使微生物 长期处于旺盛生长阶段。
位体积培养物在单位时间内的O2消耗、糖消耗或产酸产CO2量等， 它们在一定程度上间接地反映细胞生物量。
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三、细菌纯培养的生长
• 以少量纯培养细菌接种一定容积的培养基中经过培养生长，最后一 次收获，此称分批培养(batch culture)。
稳定期 对数期 滞留期
衰亡期
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• 必须根据待试微生物的形态、生理性状来选择适当的方法。
• 同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生 长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持2~3个世代，又逐渐转变 为随机生长，即非同步化。
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第二节 真菌的生长
一、菌丝的生长繁殖
菌丝生长与营养有关。营养丰富，分支多而密，营养贫乏 ，分支少而稀。
生物生态体系比较理想的实验模型，因为，生长在自然界的微生物 一般都处于低营养浓度条件下，生长也较慢。而恒定连续培养正好 可通过调节控制系统来维持培养基成分的低营养养浓度，使之与自 然条件相类似。
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第23页，幻灯片共66页
五、同步培养
• 在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。如 果以群体测定结果的平均值来代表单个细胞的生长或生理特性是不 符合客观实际的，然而利用单个细胞进行研究又是很困难的。为了 解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个 体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。
也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤、5-氟脱氧尿苷、 羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞DNA合成的同
步化均有作用。
第27页，幻灯片共66页
• 总之，机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多， 应用较广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解 很少，化学诱导同步化的本质还是一个尚待研究的问题。
•稀释培养测数法（又称最大概率法，MPN most probable
number）
第9页，幻灯片共66页
• 细胞生物量测定
①细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。 ②总氮量测定法：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的
含量。
③DNA含量测定法：用荧光法测定微生物细胞中DNA含量。 ④代谢活性法：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。如单
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• 并不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长 的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐 渐下降的曲线。
• 认识和掌握细菌生长曲线，对指导发酵生产具有很大作用： • 计算生长速率和代时；
• 不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解了这些， 就能根据需要进取样和收获；
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• 利用选择培养基分离法 根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：
①分离真菌用马丁氏培养基，pH偏酸；分离放线菌用高氏1号，pH中 性偏碱。
②不同菌对化学试剂的敏感性：分离放线菌，培养基中加10%酚， 抑制细菌、真菌；从土壤中分离真菌，加孟加拉红，抑制细 菌生长。
③根据分离对象的营养特征：分离能发酵纤维素的菌株，培养基 以纤维素为唯一碳源。分离固氮菌，用无氮培养基。
第20页，幻灯片共66页
• 恒浊连续培养 • 不断调节流速而使细菌培养物浊度保持恒定的连续培养叫恒浊连
续培养。
• 由光电装置检测培养容器中的浊度，根据浊度变化控制新鲜Байду номын сангаас养液流入 和旧培养流出速度，使容器内菌液浓度恒定。
• 工业发酵中用此法可获得大量菌体及代谢产物。
第21页，幻灯片共66页
• 恒化培养 • 控制恒定流速，使由于细菌生长而耗去的营养物及时得到补充，
• 如果某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围 时，就会对机体产生抑制乃至杀灭作用。
第3页，幻灯片共66页
第一节 纯培养微生物群体的生长
• 微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物， 必须把研究对象从混杂群体中分离出来。
• 微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得 到的后代称为纯培养pure culture。
第17页，幻灯片共66页
④衰亡期(decline phase) • 细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负
生长”。其中有一段时间，活菌数换几何级数下降，故有人称 之为“对数死亡阶段”。 • 这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物， 如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多 种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡， 革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。
• 硝酸纤维薄膜法 • 机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的
生命活必然较为正常。但此法有其局限性，有些微生物即使在相同的 发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采 用这类方法。
第25页，幻灯片共66页
• 调整生理条件的同步法（诱导法）
• 温度调整法 将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时 间，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培 养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分 裂。
第12页，幻灯片共66页
• 在对数生长期内，细菌数目的增加是按指数级数增加的，即 20 →2
1 →22 →23 ……2n
• 这里的指数 n 为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌 繁殖n代产生2n 个细菌。
• 如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1 ，繁殖 n 代后到对数期后期t2 的菌数为 x2，则代时（Generation time，G）（即每增加一代所 需要的时间）应为：
• 营养条件调整法 即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。 例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而 获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同 步生长。
• 用最高稳定期的培养物接种
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• 抑制DNA合成法 • 利用代谢抑制剂阻碍DNA合成相当一段时间，然后再解除其抑制，
• 例如：在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 104 /ml，经过培养 4
h后，又测得菌液中的细菌数为 108 /ml，求此菌的世代时间和在
此时间内繁殖的代数。
• 根据公式：G = （t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
t2 - t1 = （4 - 0）× 60 min = 240 min
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• 在多细胞微生物中，如某些霉菌，细胞数目的增加（菌丝细胞的 不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只 有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做 繁殖。
• 在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进 行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程 就是发育development。
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• 稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等， 大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就 应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高；
• 这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的 大量形成也在此时期。
• 从上可以看出，稳定期的微生物，在数量上的达到了最高水平，产物的 积累也达到了高峰，此时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在 着一定关系，这种关系，生产上称为产量常数。
• G=（t2 - t1）/n
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先求代数n
由于x2 = x1·2n lgx2 = lgx1 + nlg2 ； n=（lgx2 - lgx1）/lg2
n = 3.3 ·lg (x2 /x1 )
即G =（t2 - t1 ）/3.3 ·lg (x2 /x1)
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关于微生物的生长与环境条 件
第1页，幻灯片共66页
• 微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自 己的代谢方式进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则 细胞质的量不断增加，体积得以加大，于是表现为生长。简单 地说，生长growth就是有机体的细胞组分与结构在量方面的 增加。
• 单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细 胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形式两个基本相的子 细胞。这种由于细胞分裂而引起的个体数目的增加，称为繁殖 reproduction。
第15页，幻灯片共66页
③稳定期(stationary phase)
• 又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老 细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速 度，又逐渐趋向零。
• 在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生 长呢?
• 这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一 系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸 如pH、氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高 速度进行生长和分裂。
又叫恒组成连续培养。这样，细菌的生长速率将取决于限制性因 子的浓度。 • 恒化连续培养多用于微生物学的研究工作中。从遗传学角度来讲， 它允许我们作长时间的细菌培养而能从中分离不出的变种；从生 理学方面看，能帮助我们观察细菌在不同生活条件下的变化，尤 其是DNA、RNA及蛋白质合成的变化；同时它也是研究自然条件下微
①延滞期lag phase （滞留适应期）
• 菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调 节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加了但细胞个体体积增大， 代谢活跃。
②对数期logarithmic growth phase
• 细菌在这个时期生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指 数级数增加，代时稳定。细胞在形态、生理等方面较为一致，是 研究微生物生理代谢和遗传变异的好材料。在工业生产中，也用 对数期细胞作为扩大培养的种子液。