小鼠肠道乳酸菌定植机制与影响分析

2 结果与分析
2.1 乳酸菌的分离鉴定结果及试验菌株
从不同发酵ห้องสมุดไป่ตู้品当中，经过分离可以得到不同类
型的乳酸菌，针对分离得到的菌株予以 16S rDNA 序
列分析以及 BLAST 比对工作，进而明确菌株的相应
种属，结果见表 1。从表 1 可以了解到，从市面销售
的酸奶当中分离得到鼠李糖乳杆菌与保加利亚乳杆
菌，从陈醋醋醅当中分离得到干酪乳杆菌和瑞士乳杆
作者简介：张艳艳（1987—），女，硕士，工程师，研究方向为婴幼儿功能性食品。
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Analysis and Testing 分析检测
胃酸可以将一些乳酸菌杀死。但在盲肠和结肠当中乳 酸菌数量相对较多，介于 106 ～ 1010 CFU·g-1[3-5]。
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出前者的情况下，则代表喂食的乳杆菌在小鼠肠道内 6 d、8 d、10 d、12 d 和 14 d 时间的小鼠粪便样品当中
6.33
6.46
6.35
6.09
瑞士乳杆菌 C36
7.50
7.64
7.50
8.07
7.41
7.39
7.41
保加利亚乳杆菌 Y3
7.58
7.67
8.01
8.12
7.96
7.84
7.81
植物乳杆菌 H7
6.01
6.11
7.16
6.42
6.90
7.01
7.01
鼠李糖乳杆菌 Y4
6.22
5.49
6.39
6.06
部定植，可持续观察并对比每株菌具体的定植量。依 所包含的 6 种乳杆菌量，结果见表 2。
次测定处在适应期最后 1 d 时间，以及完成灌胃 4 d、
表 2 不同小鼠粪便样品中 6 种不同乳杆菌的含量表
乳杆菌类型
适应期
4d
乳杆菌数量
6d
8d
10 d
12 d
14 d
发酵乳杆菌 Z1
6.15
5.50
6.36
中图分类号：TS201.3
乳酸菌是基于发酵碳水化合物生成众多乳酸细菌 的集合体，其在益生菌家族当中，属于十分关键的菌 株之一，其在参与改善肠道菌群平衡状态、参与免疫 应答以及抑制肠道病原菌生长繁殖等一系列益生功能
方面，有着不容忽视的作用 [1-2]。从人体内乳酸菌数量 和种类最为丰富的部位——消化道来看，乳酸菌种类 与数量也由于消化道部位的区别，而有着比较明显的 差异。其中，胃中的乳酸菌数量相对最少，这是因为
6.31
6.37
6.43
干酪乳杆菌 C6
6.41
6.72
8.03
7.14
7.36
7.42
7.57
注：乳酸菌数量 =lg[ 拷贝数 / 粪便质量 (g)]
由表 2 当中能够了解到，在灌胃完成后的两周时 间内，小鼠粪便当中植物乳杆菌及干酪乳杆菌的量明 显超出了灌胃之前的含量，可见植物乳杆菌 H7 与干 酪乳杆菌 C6 均已超出肠道中该种菌原始状态一个数 量级的水平，进而实现至少定植 14 d。而对于瑞士乳 杆菌 C36、鼠李糖乳杆菌 Y4 以及发酵乳杆菌 Z1 来讲， 则并未在小鼠肠道内部定植。保加利亚乳杆菌 Y3 通 过相对较少的定植量，实现了定植 8 d。
在本试验当中，运用平板培养的方式，分离出传 统发酵食品当中所包含的乳酸菌，筛选出不同类型的 乳杆菌各 1 株，将其制作成为混合菌，完成液灌胃小 鼠工作 [6]。借助于实时荧光定量 PCR 技术，进一步检 测灌胃混合菌液之前、之后小鼠粪便当中 6 种不同乳 杆菌数量所发生的具体变化，由此探索菌株具有的定 植特性，掌握乳杆菌在小鼠肠道当中的定植能力状况。
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doi:10.16736/41-1434/ts.2022.13.048
小鼠肠道乳酸菌定植机制与影响分析
Mechanism and Influence Analysis of Intestinal Lactobacillus Colonization in Mice
◎ 张艳艳 （汉臣氏（沈阳）儿童制品有限公司，辽宁 沈阳 110000）
ZHANG Yanyan (High Change (Shenyang) Children’s Products Co., Ltd., Shenyang 110000, China)
摘 要：乳酸菌被视为一类重要的无芽孢革兰氏阳性菌，可以直接利用碳水化合物实现发酵产酸，在益生 菌家族当中扮演着重要的角色，具备调节肠道菌群平衡状态、参与免疫应答以及抑制肠道病原菌生长繁殖等一 系列的益生效果。从以往发酵食品当中分离出乳酸菌 22 株，主要涵盖植物乳杆菌 7 株、干酪乳杆菌 3 株、发酵 乳杆菌 3 株、瑞士乳杆菌 5 株、鼠李糖乳杆菌 2 株以及保加利亚乳杆菌以及嗜热链球菌各 1 株等。从以上乳酸菌 当中，筛选出 6 株不同类型的乳杆菌开展动物实验。借助于实时荧光定量 PCR 技术，探索不同阶段小鼠粪便当 中各类乳杆菌的实际数量，分析其在小鼠肠道当中具有的定植能力。由此为工业应用菌株整体功能性的评价及 筛选提供相应的参考借鉴依据。
借助于特异性 PCR 引物开展荧光定量 PCR，能 够有效定量粪便样品当中包含的不同乳杆菌。经过一 系列的检验，此类引物有着良好的特异性，可以抵抗 同属不同种乳杆菌带来的干扰。6 种乳杆菌标准曲线 有着较高的相关性，可见 PCR 所处的条件十分适宜， 引物特异性相对良好，这一方法可以应用在粪便样品 乳杆菌的有关定量检测工作方面。将小鼠作为实验动 物模型，检测 6 株乳杆菌在肠道当中具有的定植能力。 从结果得知，不同菌株具有的定植能力差异比较明显， 而定植能力大小在不同种间是否也具有差异，仍需要 予以深入研究。
菌，从东北酸菜中分离得到植物乳杆菌，从老面团当
中分离得到酵乳杆菌。从分离得到的 6 种不同菌株当
中，筛选出 6 株乳杆菌（植物乳杆菌 H7、干酪乳杆菌
C6、鼠李糖乳杆菌 Y4、发酵乳杆菌 Z1、瑞士乳杆菌
C36 和保加利亚乳杆菌 Y3）开展后续的动物实验，进
而测定其在小鼠肠道当中所具有的定植能力。
表 1 不同类型发酵食品中分离的具体结果表
关键词：乳酸菌；肠道定植；聚合酶链式反应（PCR）；实验 Abstract：Lactic acid bacteria are regarded as an important class of non-spore gram-positive bacteria, which can directly use carbohydrates to ferment and produce acid. They play an important role in the probiotic family, and have the ability to regulate the balance of intestinal flora and participate in immune responses and a series of probiotic effects such as inhibiting the growth and reproduction of intestinal pathogens. 22 strains of lactic acid bacteria were isolated from previous fermented foods, mainly including 7 strains of Lactobacillus plantarum, 3 strains of Lactobacillus casei, 3 strains of Lactobacillus fermentum, 5 strains of Lactobacillus helveticus, 2 strains of Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus and Lactobacillus bulgaricus 1 strain of Streptococcus thermophilus and so on. From the above lactobacilli, 6 different types of lactobacilli were screened for animal experiments. With the help of real-time fluorescence quantitative PCR method, the actual number of various types of lactobacilli in mouse feces at different stages was explored, and their colonization ability in the mouse intestine was analyzed. This provides a reference basis for the overall functional evaluation and screening of industrial strains. Keywords：lactic acid bacteria; intestinal colonization; polymease chain reaction (PCR); experiment
1 材料与方法
1.1 试验材料 东北酸菜、酸奶，均来自市面销售；陈醋醋醅，
源自陈醋醋酸发酵时期；发酵面团，源自农家自制的 老面团。 1.2 培养基与试剂
MRS 培养基：蛋白胨 10 g，牛肉膏 10 g，酵母粉 5 g， 葡萄糖 20 g，K2HPO4 2 g，柠檬酸二铵 2 g，乙酸钠 5 g， 吐温 -80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g， 蒸馏水 1 000 mL，pH 6.2 ～ 6.4；Fast DNA Spin Kit for Soil 试剂盒，由北京联立信生物科技有限公司所生产； Taq DNA 酶、dNTPs、10×PCR buffer， 由 天 根 生 化 科技有限公司所生产；SYBR Green Supermix，BIORAD；琼脂糖回收试剂盒，由天根生化科技有限公司 所生产；其他相关的化学试剂，由国药集团化学试剂 有限公司所生产。 1.3 方法 1.3.1 乳酸菌分离和鉴定工作
将不同类型的发酵食品样品相继在生理盐水当中 进行振荡处理，对上述样品溶液进行 10 倍梯度稀释， 选 择 相 符 的 稀 释 度， 开 展 MRS 平 板 涂 布 工 作， 在 37 ℃恒温培养箱当中，培养时间持续 48 h。在看到长 出单菌落的情况下，挑选出不同形态与大小的菌落进 行划线纯化处理。在完成 3 次分离纯化工作之后，针 对菌株进行革兰氏染色镜检，并且最终确定菌株所处 的形态。将完成镜检之后的菌株接种在 MRS 液体培 养基当中进行传代培养，并将其保存在 MRS 斜面培 养基当中，在 4 ℃冰箱环境中进行保藏与备用。 1.3.2 动物实验方案
来源 市面销售
陈醋醋醅 东北酸菜 发酵老面团
菌株类型 鼠李糖乳杆菌 嗜热链球菌 保加利亚乳杆菌
瑞士乳杆菌 干酪乳杆菌 植物乳杆菌 植物乳杆菌 发酵乳杆菌
数量 / 株 2 1 1 5 3 2 5 3
2.2 乳杆菌在小鼠肠道的定植能力 采集实验组小鼠在灌胃混合菌液之前与之后的粪
便样品。借助于 Fast DNA Spin Kit for Soil 试剂盒，提 取粪便样品的相应基因组 DNA。将以上基因组 DNA 作为模板，运用 6 对乳杆菌特异性引物，开展荧光定 量 PCR 扩增工作，进而获得 Ct 值。将不同乳杆菌标 准曲线换算成为拷贝数，由此得到每克粪便样品当中 所包含的 6 种乳杆菌量。对比接受乳杆菌处理之前与 之后的小鼠粪便当中以上乳杆菌实际含量，在后者超
将用于实验研究的 16 只小鼠随机分成两组，一组
作为实验组，而另外一组则作为对照组。两组小鼠在 经过 1 周时间的适应期之后，进入干预期。在干预期内， 实验组每天灌胃总量应达到 6×108 CFU 的混合菌粉， 灌胃时间为 2 周。对照组小鼠灌胃相同总量的脱脂乳。 收集两组不同的小鼠在灌胃之前，以及灌胃之后 4 d、 6 d、8 d、10 d、12 d 和 14 d 的粪便样品，在 -80 ℃环 境下进行保存和备用。