猪瘟病毒通用型RT—LAMP方法的建立与应用

文 章 编 号 １ ６ ７ ２ — ９ ６ ９ ２ （ ２ ０ １ ３ ） ０ ４ — ０ ０ ５ ０ — ０ ４
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【 摘 要】 本研究根据猪瘟病毒（ Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ ） 基 因组的Ｎ Ｓ ５ Ｂ 基因片段， 设计 了４ 条针对 Ｎ Ｓ ５ Ｂ 基因 ６ 个位 点的 Ｒ Ｔ － Ｌ Ａ Ｍ Ｐ 扩增 引物 ， 建 立的方法 能特 异性地检 测 出Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ ， 而Ｐ Ｒ Ｖ 、 Ｐ Ｐ Ｖ 、 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 、 Ｐ Ｃ Ｖ 、 Ｆ Ｍ Ｄ Ｖ 等病毒扩增结果 均为 阴性； 该方法与猪瘟 荧光 Ｒ Ｔ － Ｐ Ｃ Ｒ 方法相 比 ， 特异性 无明显 差异 ， 敏 感性高１ ０ 倍； 另外 ， 该 方法耗 时短 ， 只需 １ ｈ ， 操作 简单 ， 不 需要 Ｐ Ｃ Ｒ 仪 等特殊仪 器， 扩 增产物 可通过 肉眼观 察 、 或加入 荧光染料在 紫外灯 下观察 特异性 荧光 、 也可通 过凝 胶 电泳检 测 ， 因 此适合从临床病料 中快速准确检 测 出猪瘟病毒感 染情 况， 适合推 广应 用于基 层和野外现场 。 【 关键词】 猪瘟 病毒 ； Ｒ Ｔ － Ｌ Ａ Ｍ Ｐ ； 快速诊 断
敏感性高 、特异 性强 、操作简单 、耗 时短、不需 因组的 Ｎ Ｓ ５ Ｂ 基 因保守 区 ６ 个位 点的 Ｒ Ｔ — Ｌ Ａ ＭＰ 反
应 引 物 ，包 括 ２条 外 引 物 Ｆ ３ ／ Ｂ ３ 和 ２条 内 引 物
［ 收稿 日期］ ２ ０ １ ３ — ０ ３ — ０ １
［ 作 者简介 ］ 兰德松 （ １ ９ ８ ２ 一） ， 男， 硕士 ， 主要从 事重重 大动物
法满足 基层 和大部 分规模 场现 场快速 检测 需求 。 Ｎ Ｓ ５ Ｂ基 因 作 为靶 序 列 ，利用 Ｌ Ａ Ｍ Ｐ在 线设 计 软
而 反转 录环 介 导等 温扩 增 （ Ｒ Ｔ — Ｌ Ａ Ｍ Ｐ ） 技 术具 有 件 Ｐ ｒ ｉ ｍ ｅ ｒ Ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｒ Ｖ ４ ，设计 了一套 针 对 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ基
并 向外排 毒，导致猪场持续感 染；母猪隐性感染 Ｒ Ｔ — Ｌ Ａ ＭＰ 检测 方法， 以方便基层现场检测需要 。
和 带毒母猪综合症普遍存在 ，这些因素导致 了猪 １ 材 料 和 方 法 瘟 不易控制和净化口 。 １ ． １ 病 毒株 和待 检材料
猪瘟 兔化 弱 毒疫 苗株
目前常用 的血清 学检测技术 ，如猪 瘟正 向间 （ ＨＣ Ｌ Ｖ） 、猪 伪 狂犬 病 病 毒 、猪 蓝 耳病 疫 苗 株 、
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ｌ
猪瘟 是 由猪 瘟 病毒 （ Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ ） 感 染 猪 和野 猪 引 特 殊设备 、成本低廉等诸 多优 点，该 技术 自２ ０ ０ ０ 起感染动物发病 并死亡 的高度传染性疾病 ，为我 年 由 日本 的Ｎ ｏ ｔ ｏ ｍ ｉ 等发 明以来 ，被广泛应用于病 国规定 的四大 强制免疫病种之一 ，我 国将其 列为 原 微 生 物 的检 测 。Ｌ Ａ Ｍ Ｐ反应 结果 非常 易于 观
参照 Ｎ Ｃ Ｂ Ｉ 上 发表 的 ４ ２
复杂 ，另外 ，经 典的病 毒分离技术耗 时更长 ，并 株 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ及 ２ ０ 株Ｂ Ｖ Ｄ Ｖ全基 因组序 列 ，利 用生物
且需要实验室细胞 培养 等特 殊条件 ，这些技 术无 学 软 件 Ｄ Ｎ Ａ Ｓ ｔ ａ ｒ 进 行 序 列 比对 分 析 ，最 终选 取
接 血凝试验和 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ试 验 不 能 区 分 免 疫 抗 体 与 感 猪 Ｏ型 口蹄 疫疫苗株 、猪 细小病毒和猪 圆环病毒
染抗体 ，病 原学检测技术 ，如常规 Ｐ Ｃ Ｒ技术 、实 为 本 中心 保 存 ； 待 检 材 料 为 辽 宁省 部 分 地 区 猪 场 时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ技术和基 因芯片技术 目前虽然 能够 较 或 门诊送检疑似猪瘟病料 。 好检 测 Ｃ Ｓ Ｆ Ｖ，但 均 需要 昂贵 的仪器 ，并 且操 作 １ ． ２ 引 物 设计 与 合 成
一
类动物疫病 ，世界动物卫 生组织将其列 为 Ａ类 察 ，反应过程 中产生 的大量焦磷 酸盐使反应液 呈
传 染 病ｎ 。该 病 在 我 国流 行 已经 有近 ８ ０年 的 历 浑 浊 ， 肉 眼 即 能 观 察 到 ， 另 外 ，利 用 浊 度 仪 能 更
史 ，对养猪业 危害严重 。近年来 ，猪瘟流 行又呈 精确地观 察浑浊程度 ；也可在 反应液 中加入 荧光 现 出一 些 新 的特 点 ：发病 日龄 小 ，大 多 见于 ９ Ｏ 染料 ，在 紫外灯下 阳性样 品会 发 出明显 的绿色 荧 日龄 以下；呈散发性流行 ，无 明显季 节性 ；持续 光 ；还可应用 电泳观察 Ｌ Ａ ＭＰ 特 征性条 带或用 酶 感染普遍存 在，临床症状大 多为非典型的温和型 切 进 行 鉴 定口 ］ 。 为此 ，本 试 验 建 立 了 快速 、 灵 猪瘟 ，尤其 是低毒力病毒在感 染猪 体 内持续存在 敏 、 特 异 且 无 需 特 殊 仪 器 的 猪 瘟 通 用 型
畜 牧 兽医
试验 综逋
猪 瘟 病 毒通 用型 Ｒ Ｔ — Ｌ Ａ Ｍ Ｐ方 法 的 建 立 与 应 用
兰德 松 ，闰明媚 ，赵凤 菊 ，顾 贵波
（ 辽 宁省动 物疫 病预 防控 制 中心 ，辽 宁
中 图分 类 号 ￥ ８ ５ ４ ． ４ ３ 文献 标 识 码 Ａ
沈 阳 １ １ ０ １ ６ ４ ）