课件10：1.2 基因工程的基本操作程序

非编码区 编码区上游
启动子
编码区
与RNA聚合酶结合位点
非编码区 编码区下游
终止子
原核细 胞的基 因结构
编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
①不编码蛋白质。
非编码区 ②调控遗传信息表达,上游有启动子， 下游有终止子
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较有利于导入受体生物中无法转录；
（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；
（4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等；(1)从基因中获取目的基因概念：基因
基因组（gene library） 部NA片段,导入 受体菌的群体中储存,各个受体菌两个切口 获得目的基因
表 DNA连接酶 达
载 体
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因 就可以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
原核细胞
真核细胞
不同点
编码区是 _连__续__的
编码区是间隔的、 不_连__续__的
都由能够编码蛋白质的编__码__区__和具有调控
相同点
作用的非__合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
通过此技术，可获取大量的目的基因。
它们有什么作用？
三、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
1、将目的基因导入植物细胞
能感染双子叶植物和祼子植物,对
（1）农杆 菌转化法
特点:
单子叶植物无感染能力
Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
（5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
3.基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子
位于基因的首端,是 RNA聚合酶结合位点
c、终止子 位于基因的末端,终止 转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
法
抗虫鉴定 鉴定 抗病鉴定
活性鉴定等
个体水平的鉴定
知识延伸——DNA分子杂交技术
该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA 解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学 发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源 互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。
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表达载体提纯→取 感受态细胞→重
卵(受精卵)→显微 组表达载体与感
注射→受精卵发育 受态细胞混合→
→获得具有新性状 感受态细胞吸收
的动物
DNA分子
四、目的基因的检测与鉴定
①导入检测：目的基因是否导入受体细胞
检测 ②表达检测
方法—— DNA分子杂交 转录检测——分子杂交
分 子 检
翻译检测——抗原抗体杂交 测
2、将目的基因导入动物细胞
方法: 显微注射技术
操作程序:
提纯含目的基 因表达载体
取受精卵
显微注射
移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌
微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
过程：Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
表达载体 与感受态 细胞混合
1.2 基因工程的基本操作程序
基因工程的基本操作程序 1、目的基因的获取 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞 4、目的基因的检测与鉴定
一、目的基因的获取
1、目的基因主要是指_编__码__蛋__白__质__的__结___构__基__因__ 请举出三个以上的例子
技术扩增目的基因
➢ 退火：冷却至55～60℃部分 引物与模板的单链DNA的特 变性
定互补部位相配对和结合
➢ 延伸：加热至70～75℃以目
的基因为模板，合成互补的
新DNA链
退火
延伸
PCR技术与DNA复制的比较
相 原理 同 点 原料
条件
PCR技术
DNA复制
DNA双链复制(碱基互补配对)
四种游离的脱氧核苷酸 模板、ATP、酶等
感受态细 胞吸收 DNA
将目的基因导入受体细胞
生物 种类
常用 方法
受体 细胞
植物细胞 农杆菌转化法
体细胞
动物细胞 显微注射技术
受精卵
微生物细胞 Ca2＋处理法
原核细胞
转化 过程
将目的基因插入 到Ti质粒的T－ DNA上→农杆菌 →导入植物细胞 →整合到受体细 胞的DNA→表达
将含有目的基因的 Ca2＋处理细胞→

（2）用 _同__一__种__限__制__酶__切断目 的基因，使其产生_相__同__ 的__黏__性__末__端____。
（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_切__口___处，再 加入适量_D_N__A_连__接__酶__，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）
过程:
质粒
同一种
目的基因 限制酶处理
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区 编码区上游
编码区
非编码区 编码区下游
启动子
与RNA聚合酶 结合位点
外显子
内含子
终止子
外显子：能编码蛋白质的序列
真核细 编码区
胞的基
内含子：不能编码蛋白质的序列
因结构 非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下游
有终止子
非编码序列：包括非编码区和内含子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原理：DNA复制
前提：一段已知目的基因的核苷酸序列
原料：模板DNA；DNA引物；
四种脱氧核苷酸；热稳 定DNA聚合酶（Taq 酶）；离子
方式：
PCR扩增仪
以_指__数__方式扩增，即__2_n （n为扩增循环的次数）
过程 变性、退火、延伸三步曲
➢ 变性：加热至90～95℃双链 DNA解链成为单链DNA
转化过程:
Ti质粒
构建
表 达 转入
农 杆
导入
目的基因
载 体
菌
植 物 细 胞
插入
植物细胞 表达 染色DNA
新 性 状

（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花粉管通道进入受体细胞。
PCR技术
DNA复制
解旋 方式 不 同 场所 点
酶
DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
体外复制
主要在细胞核内
热稳定的DNA聚合酶 细胞内含有的
(Taq酶)
DNA聚合酶
结果
在短时间内形成大量的 DNA片段
形成整个DNA 分子
二、基因表达载体的构建——核心
1.过程: （1）用一定的__限__制__酶___切割 质粒，使其出现一个切口，露 出_黏__性__末__端_____。