尼古丁和神经尼古丁受体CHRNA3调控Hippo通路促进食管癌的生长和侵袭转移

尼古丁和神经尼古丁受体CHRNA3调控Hippo通路促进食管癌的
生长和侵袭转移
本研究通过对食管癌基因组进行甲基化测试,发现神经尼古丁受体
3(CHRNA3)启动子区域在食管癌细胞系中高甲基化,并用realtime PCR和western blot方法验证了CHRNA3在食管癌临床样本中蛋白表达量,发现CHRNA3在部分食管癌临床样本中下调。

为了解CHRNA3下调对食管癌细胞的生物功能影响,我们在食管癌细胞系中敲降CHRNA,通过MTT生长曲线实验,发现敲降CHRNA3导致食管癌细胞生长速率增加,侵袭转移能力升高。

同时我们验证了尼古丁对食管癌细胞生长和侵袭转移能力的促进作用。

免疫荧光实验显示向食管癌细胞培养基中添加尼古丁或敲降尼古丁受体CHRNA3均能导致Hippo通路重要转录因子YAP1(Yes-associated protein1)入核,并激活其下游基因的转录。

我们用realtime PCR方法验证了食管癌细胞中YAP1下游基因在经过尼古丁处理或敲降尼古丁受体CHRNA3之后被上调。

我们对敲降尼古丁受体CHRNA3或尼古丁处理食管癌细胞之后激活YAP1的分子机制做了进一步研究,通过免疫共沉淀,GST标记蛋白pull down,荧光共定位方法我们验证了神经尼古丁受体CHRNA3与YAP1之间的物理相互作用。

接着我们探讨了CHRNA3对YAP1的调控机制,发现添加尼古丁和或敲降尼古丁受体CHRNA3之后YAP1的蛋白水平增加,而S127位点磷酸化的YAP1水平降低,YAP1与其负调控蛋白P-catenin,14-3-3的相互作用减弱,同时YAP1与P63的相互作用也减弱,因而促进了P63的降解,并抑制食管癌细胞的凋亡。

PKC特异性抑制剂Enzastaurin能够促进YAP1的降解,并且抑制尼古丁对YAP1的激活作
用。

通过免疫组化实验,我们发现YAP1在相当一部分的食管癌样本中上调并入核。

CHRNA3在部分食管细胞中高表达,在部分食管癌细胞中则低表达。

根据文献报道,CHRNA3能与14-3-3,α-catenin, β-catenin能够相互物理作用,结合本研究中发现,我们得出以下结论,CHRNA3在细胞膜上参与形成磷酸化YAP1负调控复合体,并对维持该复合体的稳定性及维持该复合体的细胞膜定位有重要作用,尼古丁作用于CHRNA3或敲降CHRNA3均能导致该复合体解聚并促使YAP1入核,而PKC抑制剂Enzastaurin能够抑制尼古丁激活YAP1作用,并且促进了YAP1的降解。

综上所述,本研究发现了一条新的尼古丁作用于尼古丁受体促进肿瘤发生发展的分子机制,尼古丁和神经尼古丁受体CHRNA3作为Hippo通路重要转录因子YAP1的上游调控因子,可激活YAP1的转录活性,从而促进肿瘤细胞的增殖,侵袭和转移,以及抗凋亡的能力,对该分子通路的干预可能成为肿瘤预防和治疗的新靶点。