Rac1抑制剂联合替莫唑胺协同抑制胶质瘤细胞增殖活性和侵袭能力的体外研究

Rac1抑制剂联合替莫唑胺协同抑制胶质瘤细胞增殖活性和侵
袭能力的体外研究
韩晓勇;王希瑞;赵志煌;尚金星;尹港峰;杨学军
【摘要】目的探讨Rac1抑制剂联合替莫唑胺对胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力的协同抑制作用.方法分别以Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺于体外培养人胶质瘤细胞系U87和U251,噻唑蓝法、细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力.结果经Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫唑胺培养后,U87和U251细胞增殖活性均降低(均P＜ 0.05),且替莫唑胺的抑制作用强于Rac1抑制剂(均P＜0.05),Rac1抑制剂联合替莫唑胺的抑制作用更强(均P＜0.05);U87和U251细胞迁移能力[U87:空白对照(78.00± 11.53)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(39.00±9.53)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(42.00± 8.54)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(18.67±10.54)细胞数/低倍视野,P=0.001,0.001,0.000;U251:空白对照
(75.00±4.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(37.00±5.56)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(36.00±9.00)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(14.33±5.50)细胞数/低倍视野,均P=0.000]和侵袭能力[U87:空白对照(64.33±4.04)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂(30.33±3.51)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(24.00±2.64)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(11.00±2.00)细胞数/低倍视野,均
P=0.000;U251:空白对照(77.33 ±3.06)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂
(40.67±4.04)细胞数/低倍视野、替莫唑胺(37.33±4.51)细胞数/低倍视野、Rac1抑制剂联合替莫唑胺(15.33±2.52)细胞数/低倍视野,均P=0.000]均降低,尤以二者联合应用降低更明显(迁移能力U87:P=0.021,0.011;迁移能力
U251:P=0.002,0.003;侵袭能力U87:P=0.000,0.001;侵袭能力U251:均P=0.000).
结论 Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力,二者联合应用更具协同抑制作用.
【期刊名称】《中国现代神经疾病杂志》
【年(卷),期】2016(016)008
【总页数】7页(P509-515)
【关键词】神经胶质瘤;rac1 GTP结合蛋白质;替莫唑胺(非MeSH词);细胞增殖;肿瘤侵润;肿瘤细胞,培养的
【作者】韩晓勇;王希瑞;赵志煌;尚金星;尹港峰;杨学军
【作者单位】061000 河北省沧州市中心医院神经外科;061000 河北省沧州市中心医院神经外科;061000 河北省沧州市中心医院神经外科;061000 河北省沧州市中心医院神经外科;061000 河北省沧州市中心医院神经外科;300052 天津医科大学总医院神经外科
【正文语种】中文
胶质瘤是临床最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，以恶性程度最高的胶质母细胞瘤为例，若仅予支持治疗，患者中位生存期不足3个月，约97%患者于发病12个月内死亡；即使予手术切除，术后辅助放射治疗和替莫唑胺（TMZ）序贯治疗的标准方案，患者中位生存期也仅为12～16个月［1］。

胶质瘤细胞的高增殖活性和侵袭能力，是患者预后不良的关键因素。

替莫唑胺作为一种新型口服烷化剂，可以较好地透过血-脑屏障，普遍应用于高级别胶质瘤的药物化疗，可以显著提高患者中位生存期，但对化疗药物的耐受程度限制了其疗效的提高，因此，有必要寻找一种联合治疗方案，以提高替莫唑胺的疗效［2］。

Ras相关C3肉毒素底物1
（Rac1）蛋白作为Rho GTP酶超家族成员，可以调节细胞伪足前端的肌动蛋白聚合，在胶质母细胞瘤中呈高表达，与肿瘤细胞的增殖活性和侵袭能力密切相关，抑制Rac1蛋白活性，可以显著降低胶质母细胞瘤细胞的增殖活性和侵袭能力［3］。

Rac1抑制剂和替莫唑胺联合作用于胶质瘤细胞会产生怎样的效果？Rac1抑制剂
能否增加替莫唑胺对胶质瘤细胞的抑制作用？本研究拟通过胶质瘤细胞系U87和
U251的体外实验加以验证。

一、实验材料
1.细胞系来源人胶质瘤细胞系U87和U251均购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所细胞库，稳定传代10代后用于本实验。

2.药品与试剂替莫唑胺由天津天士力制药集团股份有限公司提供，二甲亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品，噻唑蓝（MTT）溶液、DMEM培养液、胎
牛血清（FBS）均购自美国Invitrogen Gibco公司，Rac1抑制剂NSC23766为
德国Merck公司产品。

Transwell穿透小室购自美国Merck Millipore公司，NanoDrop ND-1000型紫外分光光度计由美国Thermo公司提供，OlympusⅨ-70型倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。

二、实验方法
1.细胞培养与分组人胶质瘤细胞系U87和U251均置于含体积分数为10%的胎牛血清DMEM培养基中，于37℃、体积分数为5%二氧化碳、饱和湿度常规培养，3 d更换1次培养基，细胞融合率达80%时传代培养。

替莫唑胺溶解于
10%DMSO溶液（100 mg/ml）保存，实验时以DMEM培养液稀释至所需浓度。

细胞培养过程中，DMSO浓度始终维持在＜0.10%以下，此浓度不会对细胞生长
产生影响。

将处于对数生长期的U87和U251细胞制成密度为100×103/ml的细胞悬液后分为4组。

（1）空白对照组（对照组）:加入等体积的DMSO溶液作为对照。

（2）Rac1抑制剂组:常规培养24 h后，加入Rac1抑制剂NSC23766
（100 μmol/L）继续培养2 h。

（3）替莫唑胺组（TMZ组）:常规培养24 h后，加入溶解于DMSO溶液的替莫唑胺，DMEM培养液稀释至所需浓度（10
μmol/L），继续培养2 h。

（4）Rac1抑制剂联合替莫唑胺组（Rac1抑制剂
+TMZ组）:于常规培养24 h后，加入Rac1抑制剂NSC23766（100 μmol/L）
和含替莫唑胺（10 μmol/L）的DMEM培养液后继续培养2 h。

2.MTT法检测胶质瘤细胞增殖活性将4组肿瘤细胞以2×103/200 μl的密度接种于96孔培养板中，分别于接种后1、2、3、4、5、6和7 d，在每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），于37℃培养4 h，弃上清液，每孔加入200 μl DMSO
溶液（100 mg/ml），轻摇20 min，紫外分光光度计测定570 nm波长处光密度值（OD值），每组重复实验3次，取平均值。

3.细胞迁移实验取处于对数生长期的U87和U251细胞，以0.25%胰蛋白酶消化，终止消化后置于含10%胎牛血清的完全培养基中，制成密度为100×103/ml的细胞悬液，将细胞悬液平铺于六孔板，继续培养至细胞融合率达70%～80%。

然后
以规格为200 μl的枪头顶端尽量垂直于六孔板底部划痕，磷酸盐缓冲液冲洗3次，去除划痕上的残留细胞，置37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养，4组分别加入不同处理试剂，24 h后于倒置相差显微镜下观察细胞迁移程度。

随机选取
3个不重复视野（×100），计数迁移至空白处的细胞数，每组重复实验3次，取
平均值。

4.Transwell细胞侵袭实验取4组肿瘤细胞100×103/200 μl，BD Matrigel基质胶70 μl均匀平铺于Transwell的聚碳酸酯膜上，37℃预置2 h聚合成凝胶备用。

每组设3个复孔，上室每孔加入200 μl细胞悬液（含100×103个肿瘤细胞），
下室每孔加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培养液。

将装有Transwell的培
养板置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度培养箱中培养24 h，弃上室培养液，取
出小室，以湿棉签擦去聚碳酸酯膜上未穿过膜的细胞，行苏木素染色，冲洗后封片，
于倒置相差显微镜下观察迁移至膜下的细胞数。

分别于每张膜的中央部分和周围部分随机选取3个不重复视野（×100），计数迁移至膜下的细胞数，每组重复实验
3次，取平均值。

三、统计分析方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理与分析。

计量资料以均数±标准差（±s）
表示，各组肿瘤细胞不同观察时间点增殖活性的比较采用重复测量设计的方差分析，两两比较行LSD-t检验；各组肿瘤细胞迁移能力和侵袭能力的比较，采用单因素
方差分析，两两比较行LSD-t检验。

以P≤0.05为差异具有统计学意义。

一、胶质瘤细胞增殖活性的比较
与对照组相比，Rac1抑制剂组、TMZ组和Rac1抑制剂+TMZ组U87和U251
细胞增殖活性均降低（均P＜0.05），其中，TMZ组较Rac1抑制剂组降低得更
明显（均P＜0.05），Rac1抑制剂+TMZ组较TMZ组和Rac1抑制剂组降低得
更明显（均P＜0.05），表明Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞增殖活性，替莫唑胺的抑制作用强于Rac1抑制剂，而二者联合应用抑制效果更明显，提示Rac1抑制剂有增强替莫唑胺抑制胶质瘤细胞增殖活性的作用（表1～3）。

二、胶质瘤细胞迁移能力的比较
与对照组相比，Rac1抑制剂组、TMZ组和Rac1抑制剂+TMZ组U87和U251
细胞迁移能力均降低（P＜0.05），尤以Rac1抑制剂+TMZ组显著（均P＜
0.05），表明Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞迁移能力，二者联合抑制效果更明显，提示Rac1抑制剂有增强替莫唑胺抑制胶质瘤细胞迁移能力的作用（图1；表4，5）。

三、胶质瘤细胞侵袭能力的比较
与对照组相比，Rac1抑制剂组、TMZ组和Rac1抑制剂+TMZ组U87和U251
细胞侵袭能力均降低（均P＜0.05），尤以Rac1抑制剂+TMZ组显著（均P＜
0.05），表明Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞侵袭能力，二者联合抑制效果更明显，提示Rac1抑制剂有增强替莫唑胺抑制胶质瘤细胞侵袭能力的作用（图2；表6，7）。

胶质瘤是临床常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，占成人颅内肿瘤的40%～50%，目前世界卫生组织（WHO）将胶质瘤分为Ⅰ～Ⅳ级4个级别，肿瘤级别越高、患者预后越差［4］。

由于胶质瘤细胞具有较强的增殖活性、迁移能力和侵袭能力，即使采取手术切除辅以术后放射治疗和药物化疗的标准治疗方案，仍易在肿瘤残腔周围或远隔部位复发，导致患者死亡。

研究显示，靶向治疗或免疫抑制治疗效果甚微［5］，患者预后不甚理想。

替莫唑胺作为一种新型口服烷化剂在胶质瘤的药物化疗中获得临床医师的广泛关注［6］。

研究显示，口服替莫唑胺即具有较好的抗肿瘤特性，且具有易透过血-脑
屏障、药物毒性作用小等优点［7-9］。

临床研究证实，替莫唑胺可以明显延长胶质瘤患者的生存期［10］。

关于替莫唑胺药理学机制，王健等［11］认为，不仅
与其活性化合物5-（3-甲基三氮烯-1-基）咪唑-4-酰胺（MTIC）的细胞毒性有关，也与其可以有效降低胶质瘤细胞增殖活性和侵袭能力密切相关。

机体内O6-甲基
鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）活性可以使患者对替莫唑胺产生耐药性，限
制替莫唑胺的临床疗效，因此，亟待寻找一种能够良好透过血-脑屏障的药物以增
强替莫唑胺疗效。

Rac1蛋白是一种广泛存在于细胞中的重要信号转导分子，与多种恶性肿瘤的发生
与发展密切相关。

Rac1基因定位于第7号染色体p22，相对分子质量为29×103，含7个外显子。

Rac1蛋白可以结合并水解鸟苷酸，具有两种活性状态，分别为结合GTP的激活态和结合GDP的非激活态，其生物学活性主要受鸟苷酸转换因子、GTP酶激活蛋白和鸟嘌呤核苷酸解离抑制因子的调节，正是由于这两种活性状态
的相互转换使Rac1蛋白在细胞增殖、分化与凋亡、细胞运动与粘附，以及转录因
子的调控中起“分子开关”作用［12］。

目前研究显示，在胶质瘤细胞侵袭和转
移过程中，肿瘤细胞伪足的形成和粘附至关重要，而在该环节中，Rac1蛋白调控伪足前端肌动蛋白骨架聚合，从而影响肿瘤细胞片状伪足的形成，在肿瘤细胞迁移、侵袭中发挥重要作用［13］。

Rac1蛋白可以激活下游p21活化蛋白激酶（PAK），活化PAK/单丝氨酸蛋白激酶1（LIMK1）/cofilin信号转导通路，进而使肿瘤细
胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力显著增强［14］。

抑制Rac1蛋白活性能否与替莫唑胺协同作用，进而抑制胶质瘤细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力，尚待进一步研究。

本研究对胶质瘤细胞系U87 和U251先予Rac1抑制剂处理，再加入替莫唑胺，采用MTT法、细胞划痕实验和Transwell
实验比较其与单纯予Rac1抑制剂或替莫唑胺处理的胶质瘤细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力，结果显示，经Rac1抑制剂、替莫唑胺、Rac1抑制剂联合替莫
唑胺处理后，U87和U251细胞增殖活性、迁移能力和侵袭能力均降低，尤以二
者联合应用时降低得更显著，表明Rac1抑制剂和替莫唑胺均可抑制胶质瘤细胞增殖，二者联合抑制效果更明显，提示Rac1抑制剂有增强替莫唑胺抑制胶质瘤细胞增殖活性的作用。

U87细胞系是胶质母细胞瘤细胞系，其增殖活性、迁移能力和
侵袭能力强于U251细胞系，本实验结果与两种肿瘤细胞系特征基本相符。

Rac1
抑制剂NSC23766可以有效抑制肿瘤细胞的迁移能力和侵袭能力，而对肿瘤细胞
增殖活性影响不大，替莫唑胺具有较强的抑制肿瘤细胞增殖活性能力，故二者联合应用可达到协同增强抑制作用效果。

Rac1抑制剂通过抑制肿瘤细胞伪足形成，联合替莫唑胺自身的抗肿瘤细胞增殖、侵袭作用，从多个途径协同抑制胶质瘤细胞的增殖活性、迁移能力和侵袭能力。

本研究为Rac1抑制剂与替莫唑胺的联合应用提供了理论指导，为进一步有效抑制胶质瘤的侵袭和转移提供了新的治疗策略。

【相关文献】
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