低DO对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究

中国环境科学 2020,40(6)：2503~2512 China Environmental Science 低DO对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究
刘国华,刘禹琛,陈 燕,章 乾,徐相龙,齐 鲁,王洪臣*(中国人民大学环境学院,低碳水环境技术中心,北京 100872)
摘要：考察了长期低溶解氧(DO)条件下推流式活性污泥系统碳和氮去除的效果,并从微生物群落结构及动力学特征方面进行了机理分析. 结果表明, 将DO浓度从2.0mg/L降低至0.3mg/L,系统仍可有效地去除污水中的碳和氮,但当DO降低至0.3mg/L时, 系统的脱氮性能波动较大. 随着DO浓度的降低, 系统中细菌的总体群落结构发生改变, 但功能菌群仍为Proteobacteria,约占65%.Nitrosomonas oligotropha、Nitrobacter winogradskyi spp.和Group1Nitrospira等是低溶解氧条件下的主要硝化细菌. qPCR结果显示DO从2.0mg/L降至0.5mg/L时硝化细菌(主要是Nitrospira)得到富集, 保证了低DO条件下的完全硝化. 硝化反应动力学分析也表明, 在一定范围内降低DO可以延迟细菌衰亡以维持活性污泥系统中硝化细菌的生物量. 本研究可为污水处理厂降低DO实现节能运行提供理论支持.
关键词：低DO；节能硝化；A/O工艺；细菌群落；推流式活性污泥系统
中图分类号：X703 文献标识码：A 文章编号：1000-6923(2020)06-2503-10
Effects of low dissolved oxygen on carbon and nitrogen removal in activated sludge process. LIU Guo-hua, LIU Yu-chen, CHEN Yan, ZHAN G Qian, XU Xiang-long, QI Lu, WAN G Hong-chen* (Low Carbon Water Environment Technology Centre, School of Environment & Natural Resource, Renmin University of China, Beijing 100872, China). China Environmental Science, 2020,40(6)：2503~2512
Abstract：Impact of dissolved oxygen (DO) on pollutant removal and bacterial community structure was evaluated in a plug-flow activated sludge system. Results show that the bioprocess could still maintain high removal efficiencies of chemical oxygen demand and nitrogen from sewage when DO concentration decreased from 2.0 to 0.3mg/L, however, the nitrogen removal efficiency fluctuated greatly. The functional bacteria Proteobacteria remained dominant (~ 65%) under lower DO conditions, yet the total bacterial community structure changed in the aeration tank. The Nitrosomonas oligotropha-like ammonia-oxidizing bacteria, Nitrobacter winogradskyi spp., and Group1Nitrospira were identified as the major contributor of nitrification under low DO conditions. The quantitative PCR analysis showed that reducing DO concentration from 2.0 to 0.5mg/L enriched the nitrifiers (mainly Nitrospira), thereby ensuring complete nitrification under low DO conditions. The kinetics coefficient analysis also indicated that reducing DO concentration did not significantly affect the nitrifying bacterial growth, but retarded their decay to ensure biomass in the activated sludge system. These results provide positive support for wastewater treatment plants for saving energy by reducing DO concentration in the aeration tank.
.Key words：low DO；energy-saving nitrification；A/O process;microbial community；plug-flow activated sludge system
曝气是生物污水处理过程中能耗最大的环节,约占污水处理厂总能耗的45%~75%[1-3].氧通过曝气过程进入水体,为活性污泥系统中硝化细菌和异养菌氧化污染物的过程提供电子受体.一般来说,活性污泥中异养细菌在利用溶解氧(DO)方面比硝化细菌竞争力更强.污水处理厂曝气池中DO浓度通常由硝化需求决定.已有许多研究表明,当DO低于2.0mg/L时,可抑制硝化细菌的生长速度[4-5],并可能导致不完全硝化.因此大多数污水处理厂在高DO 条件下(≥2.0mg/L)运行,以建立稳定的硝化细菌群落确保完全硝化需求[6].
为节约污水处理厂的能量消耗,国内外的研究人员一直致力于检验硝化细菌在低DO情况下的适应情况.宗宫功等[7]认为DO降低到1.0mg/L时不会影响氨氧化细菌(AOB)的生长,但会影响亚硝酸盐氧化细菌(NOB)的生长;王歆鹏等[8]的研究发现DO 浓度低于0.8mg/L时会抑制NOB生长,但可促进AOB的生长;Stenstrom等[9]揭示了DO浓度在0.3mg/L以下时硝化反应无法发生;Wagner等[10]证明了DO浓度在1.5mg/L以上才能实现有效的硝化作用.但是,也有研究表明,在好氧活性污泥系统中,低DO不仅可以提高污泥的氧传质效率[11],还可以提高污泥的生物量[12],也可以实现完全硝化.Park 收稿日期：2019-12-06
基金项目：中国人民大学科学研究基金项目(2018030194)
* 责任作者, 教授,***********.cn
2504 中国环境科学 40卷
等[13]基于小试实验研究表明DO浓度在0.12mg/L时仍能实现稳定的硝化作用;Liu等[14]分别在污泥停留时间(SRT)为10天和40天的序批式活性污泥法(SBR)小试装置中考察了低DO浓度对活性污泥硝化性能的长期影响,结果表明在两个污泥龄下,分别可以在溶解氧浓度为0.37mg/L和0.16mg/L时实现完全的硝化.另外,在低DO浓度下,关于硝化细菌的群落结构和动力学特点的研究结果也不一致.Park等[13,15]的研究表明,在长时间的低DO浓度运行的系统中,AOB 的优势菌发生了改变,由N. oligotropha变成了N.europaea, DO浓度在1.0mg/L以下的环境更有利于N. europaea类AOB的富集.Liu等[14]的研究发现,在低溶解氧环境下硝化细菌的内源衰减速率降低,从而使得系统内硝化细菌的生物量增加,生物量的增加使得在低DO浓度下实现充分的硝化作用.
综上所知,低DO条件下活性污泥系统的硝化能力、硝化细菌群落结构及其动力学特征的研究还不充分,污水处理厂采用低DO运行还缺乏理论支撑.本课题组已发表了DO从3.0mg/L降低到0.2mg/L时A/O小试系统的部分除碳脱氮效果和细菌群落结构的变化情况[15-16],为进一步全面了解降低DO时A/O小试系统的功能,本研究结合前述发表的结果,考察了更低DO条件下(2.0~0.3mg/L)系统除碳能力和总细菌结构的变化情况,并在以前发表过的DO变化对A/O小试系统脱氮效果和硝化细菌多样性影响的基础上,进一步考察了硝化细菌的群落结构、丰度(基因拷贝数)以及动力学特征的变化情况,以期更加全面地揭示污水厂曝气池单元的低DO 运行理论,为降低推流式污水处理厂的DO浓度实现低能耗运行提供理论支持.
1材料与方法
1.1实验装置及运行参数
采用A/O模式(V A:V O=1:4)的推流式生物反应器(37.5L)(图1),水力停留时间(HRT)为9h.沉淀池的体积为24L.使用荧光DO仪(天健创新,北京)监测DO浓度.
生物反应器运行过程中,温度保持在20~25℃, pH值控制在7.5至8.5,通过定期排泥将污泥停留时间(SRT)调节为20d.进水流量为96L/d,混合液回流比(R)为200%,污泥回流比(r)为150%.在开始阶段以2.0mg/L的DO水平进行运行,稳定后将DO分别逐步降至1.0mg/L、0.5mg/L和
0.3mg/L.
图1 推流式活性污泥系统示意
Fig.1 Diagram of plug-flow activated sludge system
1.污水;
2. 污水桶;
3. 进水泵;
4. 搅拌器;
5.缺氧池;
6. 好氧池;
7. 曝气头;
8. 荧光DO仪;
9. 沉淀池;10.排水管;11.硝化液回流泵;12. 污泥回流泵
1.2接种污泥及实验用水
接种污泥取自北京北小河污水处理厂好氧池.合成污水组成如下:NaAc·3H2O 0.67g/L、NH4Cl 0.2g/L、NaHCO3 0.09g/L、KH2PO4 0.07g/L、CaCl2 0.0013g/L、MgSO4·7H2O 0.006g/L、1ml/L微量元素溶液,微量元素溶液含有MnCl2·4H2O 0.19mg/L、ZnSO4·7H2O 0.12mg/L、CuCl2·2H2O 0.022mg/L、FeCl3·6H2O 0.88mg/L、CoCl2·6H2O 0.21mg/L、NiCl2·6H2O 0.025mg/L. 污水的COD和氨浓度分别为300~400mg/L和45~55mg/L.
1.3水质分析
系统运行期间每隔1~2d取水样测定进出水水质,采用国标法进行测定[17],每个水样进行3次测定.检测项目包括COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N 和TN浓度.
1.4生物结构群落分析
1.4.1 DNA提取活性污泥中微生物DNA提取采用玻璃珠振荡-十二烷基硫酸钠(SDS)-氯仿异戊醇法[18].首先向活性污泥离心液中加入13.5mL DNA 提取缓冲液(100mmol/L Tris–HCl [pH 8.0], 100mmol/L sodium EDTA [pH 8.0],100mmol/L sodium phosphate [pH 8.0], 1.5mol/L NaCl, 1% PVPP, 1% CTAB) and和100mL蛋白酶K(10mg/mL).在37°C、225r/min震荡30min后,加入1.5mL 20%SDS,65℃水浴2h,每20min倒置一次.室温下6000r/min离心10min后收集上清液,并转移到50mL离心管中.添加4.5mL DNA提取缓冲液和0.5mL 20%SDS,将细胞
6期刘国华等：低DO对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究 2505
沉淀物再提取2次,涡旋离心10s, 65℃水浴2h,重复离心操作.将3次上清液合并,与等体积氯仿-异戊醇(24:1,V/V)混合.离心回收水相,室温下用0.6体积的异丙醇沉淀1h.室温下16000r/min离心20min, 70%冷乙醇洗涤后加入TE缓冲液溶解沉淀即得到样品总DNA.利用DNA纯化试剂盒(Solarbio,中国)对粗提液DNA进行纯化.
向PCR仪(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)加入22µL PCR试剂(Invitrogen),1µL模板DNA和1µL引物,进行PCR扩增.表1显示了各菌种PCR扩增信息.
1.4.2 PCR-DGGE分析采用D-code基因变性系统(Bio-Rad,美国)对PCR反应产物进行分离,使用10%聚丙烯酰胺凝胶,变性剂浓度分别为25%至55%(对于AOB), 45%至70%(对于Nitrospira)和35%~70%(对于Nitrobacter),在60℃、110V电泳7h,经SYBR-Green I(1:10,000)染色30min后,进行凝胶成像获得指纹图谱.使用Quantity One软件(Bio-Rad)进行数据分析.
切取DGGE凝胶上目的条带,并使用相同的引物进行扩增.用DNA纯化试剂盒(Solarbio,中国)纯化后,由商业测序公司(Sunbiotech,中国)进行测序.利用BLAST分析基因序列与Gen Bank中收录的基因序列的同源性,采用MEGA 6系统构建系统发育树[25]. 1.5硝化细菌特定基因实时PCR分析
对DNA样品进行实时PCR测定,以确定在不同DO浓度下硝化细菌种群的丰度变化.通过Nitrobacter和Nitrospira的amo A基因和16S rRNA 基因,测定氨氧化细菌(AOB),亚硝化细菌(NOB)的丰度.定量PCR反应体积为20µL,包括1µL模板DNA,0.8µL (10µmol/L)引物,10µL SYBR GreenⅠ混合液(Transgen Biotec,中国)以及超纯水.每种测定的引物序列如表2所示,由102~108copies/μL质粒DNA (Transgen Biotec,中国)制备.每个样品进行3次平行实时PCR测定.
表1PCR扩增条件
Table 1 PCR amplification information
菌种引物引物序列扩增方法参考文献
357f- GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGGUCCTACGGGAG
G CAG CAG
总细菌
(Total bacterial)
518r ATTACCGCGGCTGCTGG 预变性:94°C加热5min;
共30循环,每个循环程序:94°C加热变性30s,
55°C 退火30s, 72°C延伸1min;
最后72°C延伸7min
[19]
amoA-f GGGGTTTCTACTGGTGGT
amoA-r-TC CCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC 氨氧化细菌
(AOB)
amoA-r-TC-GC CGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG
CCCCCTCTGCAAAGCCTTCTTC
预变性:94°C加热5min;
共40循环,每个循环程序:94°C加热变性
1min, 55°C 退火90s, 72°C延伸90s;
最后72°C延伸10min
[20]
NSR 1113f CCTGCTTTCAGTTGCTACCG 硝化螺菌
(Nitrospira) NSR 1264r GTTTGCAGCGCTTTGTACCG 预变性:94°C加热5min;
共40循环,每个循环程序:94°C加热变性30s,
65°C 退火30s, 72°C延伸30s;
最后72°C延伸15min
[21]
F1370F1nxrA CAGACCGACGTGTGCGAAAG 硝化杆菌
(Nitrobacter) F2843R2nxrA TCCACAAGGAACGGAAGGTC 预变性:94°C加热3min;
共35循环,每个循环程序:94°C加热变性30s,
55°C 退火45s, 72°C延伸45s;
最后72°C延伸5min.
[20]
表2qPCR扩增条件
Table 2 Primers and programs for real-time PCR amplification
菌种引物引物序列扩增方法参考文献
氨氧化细菌(AOB)
AmoA-1f
AmoA-2r-TC
GGGGTTTCTACTGGTGGTCCCCTCTGC
AAAGCCTTCTTC
预变性:95°C加热5min;
共40循环,每个循环程序:95°C加热变性30s, 55°C
退火45s, 72°C延伸45s
[22]
硝化螺菌(Nitrospira) NSR1113f
NSR1264r
CCTGCTTTCAGTTGCTACCGGTTTGCAG
CGCTTTGTACCG
预变性:95°C加热5min;
共40循环,每个循环程序:95°C加热变性30s, 56°C
退火30s, 72°C延伸30s
[23]
硝化杆菌(Nitrobacter) F1370F1nxrA
F2843R2nxrA
CAGACCGACGTGTGCGAAAGTCCACA
AGGAACGGAAGGTC
预变性:95°C加热5min;
共40循环,每个循环程序:95°C加热变性30s, 55°C
退火45s, 72°C延伸45s
[24]
2506 中 国 环 境 科 学 40卷
1.6 硝化反应过程动力学特征分析
使用呼吸仪测定硝化细菌的比好氧速率(SOUR)和内源性SOUR,确定硝化细菌的最大氨氧化速率(AORm)、最大亚硝酸盐氧化速率(NORm)和衰减速率(K d ).测定AOR 和NOR 并与Monod 方程拟合,确定硝化反应器的氨亲和常数(K NH )、亚硝酸盐亲和常数(K NO2)、氧亲和常数(K DO )和净生长速率(µm ). 2 结果与讨论
2.1 不同DO 条件下COD 和氮去除效果
曝气池DO 浓度对污水生物处理过程中COD 和氮的去除至关重要.一般情况下,DO 浓度控制在2.0mg/L 以上,保证较高的污染物去除率[6]
,但能耗较高. 本文研究了DO 浓度从2.0mg/L 降至0.3mg/L 污染物去除性能. DO 浓度在启动阶段(约60d)控制在2.0mg/L 左右.系统稳定后,DO 分别降至1.0mg/L 、0.5mg/L 、0.3mg/L 左右,持续约6个SRTs (SRT=20d). COD 和氮的去除率分别见图2和图3.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
C O
D 去除率(%)
C O
D (m g /L )
时间(d)
20
40
60
80100
图2 不同DO 条件下COD 去除效果
Fig.2 COD removal effect under different DO conditions
从图2和图3可以看出,在DO 变化初期, COD 和氮的去除率产生波动,但在运行1~2个SRTs 后,系统的COD 和氮素去除率趋于稳定. COD 、NH 4+-N 和TN 的平均去除率分别为86.7%、98.5%和86.2%. 当DO 降至约1.0mg/L 和0.5mg/L 时,COD 、NH 4+-N 和TN 的去除效率没有明显变化.当DO 进一步降低至约0.3mg/L 时,推流式活性污泥系统仍能保持良好的COD 去除性能,但脱氮效果波动较大,但在稳定了
约2个SRTs 后NH 4+-N 和TN 的平均去除率仍可分别到95.4%和83.46%.
去除率(%) 氮素(m g /L )
时间(d)
进水TN 出水TN
进水氨氮出水氨氮 出水硝酸盐
TN 去除率 0
204060
80100
图3 不同DO 条件下氮素去除效果
Fig.3 Nitrogen removal effect under different DO conditions
以上结果表明,推流式活性污泥工艺在高DO 工况下(约2.0mg/L),和低DO 工况下(约1.0mg/L 和0.5mg/L)均能较好地去除废水中的COD 和氮.其他
研究已在低DO 条件下对废水COD 和氮的去除进行了研究,探究了膜曝气/过滤生物反应器对COD 和氮的去除效果[26-
32],但是本研究的低DO 系统比文
献报道的TN 去除效率更高[33-
34]. DO 浓度并不是活
性污泥法中COD 去除的限制因素,即使DO 浓度降至较低的值(本研究为0.3mg/L),COD 的去除效果依然很好.然而,DO 是推流式活性污泥系统脱氮的重要影响因素.在本研究中,当DO 浓度降低到0.3mg/L 时,系统的脱氮性能波动较大,这可以从以下三个方面的原因进行理解:首先,由于DO 的降低导致了亚硝酸盐积累,从而造成了系统脱氮性能不稳定且氨氮和总氮的平均去除率有所降低.这可以解释为亚硝酸盐氧化过程比氨氮氧化过程对DO 浓度变化更敏感[35-
36],而且亚硝酸盐的积累对AOB 、NOB 和反
硝化细菌均有抑制[37-
38];其次,活性污泥系统的脱氮
能力除了受DO 影响外,还与SRT 有关[14].当DO 降到比较低的水平时,需要较长的SRT 来弥补,而本研究的SRT 为20d,对于有脱氮要求的推流式活性污泥系统而言,当DO 降低到0.3mg/L 时,更长的SRT (>20d)才能满足脱氮需求,Liu 等[14]的研究结果也证明了这一点,他们考察了SRT 为10d 和40d 两种情
6期 刘国华等：低DO 对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究 2507
况下,当DO 降低到0.2mg/L 时,在SRT 为10d 的系统中硝化效果很难达到稳定,而在SRT 为40d 的系统中硝化效果较为稳定;最后,当DO 降低到0.3mg/L 时,系统曝气池中污泥容易沉降,泥水难以达到充分混合,从而造成脱氮效果不稳定且有下降趋势.
因此,对于A/O 模式下SRT 为20d 的推流式活性污泥工艺的实际污水处理厂,最优DO 浓度可设定为0.5mg/L.中国5000多个污水处理厂(截至2019年6月)大部分在高DO 条件下运行(≥2.0mg/L),如降低DO 运行,污水处理厂能够显著降低运行能耗. 2.2 微生物群落结构分析
2.2.1 总细菌群落结构分析 图4是系统总细菌随DO 变化(2.0~0.3mg/L)的DGGE 图谱和系统发育树，其中部分DGGE 和系统发育树数据(2.0mg/L 、1.0mg/L 和0.5mg/L)来源于本课题组以前发表的数据[15].如图4A 所示,各DO 条件下活性污泥系统16S rDNA 序列的DGGE 图谱均呈现条带数量和丰度的变化,说明优势菌群随DO 浓度变化而变化.低DO 水平下的条带4、8、9和10比高溶解氧水平下亮度更高,而溶解氧变化范围在2.0mg/L 至0.3mg/L 时,条带5、6、7和12变暗. DO 从2mg/L 降至0.5mg/L 时,条带16保持不变,但当DO 降至0.3mg/L 时,条带消失.结果表明,活性污泥系统中的优势细菌群落在不同DO 浓度下发生了改变.
图4B 所示的系统发育树显示,从DGGE 条带获得的16S rDNA 序列基本一致.低DO 好氧池细菌序列与变形菌序列存在较高的同源性,占生物反应器总菌数的65%,其中Alpha -Proteobacteria 约占41%, Gamma -Proteobacteria 约占18%,Beta - Proteobacteria 约占6%.其它序列与Chloroflexi 、Nitrospira 和未知细菌序列十分相似.这一结果与其它文献报道的高DO 活性污泥体系中Proteobacteria 数量一致[39-
42],说明低DO 条件下主要细菌群落变
化较小,保证了低DO 条件下活性污泥系统具有良好的污染物去除性能.Proteobacteria 在去除废水中的有机化合物和营养物质方面发挥重要作用[43]. Thiothrix sp.、Acanthamoeba sp.和uncultured Amaricoccus sp.等细菌,随着DO 的减少而显著减少,表明它们不能适应低DO 环境.而uncultured Chloroflexi 、Brucellaceae 、Hyphomicrobiaceae 等细菌可以适应低DO 环境.
细菌群落结构的适度动态变化是适应环境变化所必需的[44-
45].本研究中DO 从2.0mg/L 降低到
0.3mg/L,导致细菌群落中等水平动态变化(约30%)[44,46],这种变化是微生物系统随DO 条件变化而引起的必要反馈,不会导致污水处理系统功能的崩溃[44],这也解释了即使DO 降低到0.3mg/L 时也不会影响COD 的降解.
A
Band 12
Uncultured α-Proteobacterium (JN371328.1) Band 1 Band 11 Uncultured Hyphomicrobiaceae bacterium (HQ183836.1) Hyphomicrobium sp. (HQ694744.1)
Band 10 Uncultured Filomicrobium sp. (JN251893.1) Hyphomicrobiaceae bacterium (KC921198.1) Band 6
Uncultured Rickettsiales bacterium (HM856558.1) Band 9
Uncultured Brucellaceae bacterium (JQ701511.1) Uncultured α-Proteobacterium bacterium clone G17.41 (DQ263344.1)
Band 8
Band 7
Uncultured Amaricoccus sp. (FJ542952.1)
Uncultured α-Proteobacterium bacterium clone HPIRR2H08 (AY852235.1) Band 4
Uncultured Chloroflexi bacterium (CU923478.1)
Chloroflexi
Band 2
Uncultured bacterium (HQ891392.1) Band 16
Nitrospira sp. (KJ598613.1) Nitrospirales
Band 15
Uncultured bacterium (KM176981.1) Band 14
Uncultured Dechloromonas sp. (KF956416.1)
β-Proteobacterium
Band 13
Uncultured bacterium (EU875576.1)
Uncultured Thiothrix sp. (JX184085.1)
Band 3
Uncultured Thiothrix sp. (KJ651233.1) Band 5
Uncultured Thiothrix sp. (JQ624269.1) Band 17
Uncultured Thiothrix sp. (KF945142.1)
γ-Proteobacterium
99
997199
9995
9896
29
45
38
5
22
98
5496
8188
663573
2167
22
160.02
B
图4 推流式活化污泥系统总细菌16s rDNA 扩增子DGGE 图谱(A)和系统发育树(B)
Fig.4 DGGE profiling (A) for 16s rDNA amplicons and phylogenetic tree (B) of the identified total bacteria in the plug -flow
activated sludge system
2508 中 国 环 境 科 学 40卷
2.2.2 硝化细菌群落结构分析 利用DGGE 图谱和系统发育树鉴定了不同DO 条件下的硝化细菌种类.该硝化细菌的DGGE 图谱来源于本课题组以前发表的数据[16],本文以此为基础对DGGE 条带中的功能硝化细菌(AOB 和NOB)进行了详细的系统发育树聚类分析.图5~7显示了不同DO 环境下硝化细菌群落结构,以及DO 从2.0mg/L 降至0.3mg/L 时硝化细菌群落结构变化.
根据图5A 和图5B,在低DO 条件下, Nitrisomonas 是主要的AOB 菌,负责氨氧化作用,这与其他研究报道的结果一致[5,7,14,46-
47]. 然而Irvin 等[45]得出了相反
的结果,他们发现不利条件下(低DO 、低NH 4+-N 、
低HRT),Nitrosospira 数量超过了Nitrosomonas .这些有争议的结果可能是由于研究条件的差异引起的.本研究在低DO 体系中,AOB 中Nitrosomonas oligotrophas 比其他Nitrosomonas 更为丰富.在之前的研究中,Gieseke 等[48]和Fitzgerald 等[49]也得出类似的结果.这可能是由于AOB 中Nitrosomonas oligotropha 的氧亲和力比Nitrosomonas 高[11,50].在各种低氧环境中[30],如含氧较少的生物膜[51]以及Schelde 河口上游低DO 和低盐度[47]区域都发现过N. oligotropha ,这表明该类AOB 适应性较强. Liu 等[14]发现,AOB 中europaea /eutropha 在各种低氧环
境同样分布广泛.
A
Nitrosomonas oligotropha Nm45 (AF272406.1) Uncultured Nitrosomonas sp. clone BW-L-6(JQ345999.1) Nitrosomonas sp. NL7 (AY958704.1) Nitrosomonas sp. Nm47 (AY123830.1)
Band7
Nitrosomonas sp. JL21 (AF327919.1) Nitrosomonas sp. Nm86 (AY123819.1)Band 10 Band 8
Uncultured Nitrosomonas sp. clone Ab5 (GQ247377.1)
Nitrosomonas ureae Nm10 (AF272403.1)
Nitrosomonas sp. AL212 (AF327918.1) Band 9
Uncultured Nitrosomonas sp. (GQ247376.1)
Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone 0716145 2-2-1-14(JX879871.1)
Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone 0618003 zhong-33 M13F (KC967935.1)
Nitrosomonas oligotropha cluster
Nitrosomonas cryotolerans Nm55 (AF272402.1)
Nitrosospira sp. Nsp65 (AY123838.1)
Nitrosospira multiformis ATCC 25196(X90822.1)
Nitrosospira sp. Nsp40 (AY123840.1)
Nitrosospira sp. Nsp57 (AY123835.1)
Nitrosospira cluster
Band 5Band 1 Band 3 Band 2 Band 4
Uncultured ammonia-oxidizing bacterium M5-26(AF272536.1) Unidentified bacterium GLII-20(AF272481.1)
Uncultured Nitrosomonadaceae bacterium clone 1 AmoA (FJ603083.1) Nitrosomonas-like cluster
Nitrosomonas nitrosa Nm90 (AF272404.1)
Nitrosomonas sp. Nm148 (AY123815.1) Nitrosomonas sp. Nm41 (AF272410.1)
Nitrosomonas communis cluster
Band 6
Nitrosomonas sp. LT-2(JN367454.1)
Nitrosomonas sp. Nm107 (AF272407.1)
Nitrosomonas halophila (AJ238541.1) Nitrosomonas halophila (AF272398.1)
Nitrosomonas europaea cluster
100
83
10045
100
100 53 5785100
100
96
91
75
75
76
100
100 100
99 80
9762 94
9851
54
30 84 50
3020 0.02
B
图5 推流式活性污泥系统中氨氧化细菌的amo A 基因扩增产物的DGGE 图谱(A)和系统发育树(B)
Fig.5 DGGE profiling (A) for the amo A gene amplicons and phylogenetic tree (B) of the identified ammonium oxidizing bacteria
of nitrifiers in the plug -flow activated sludge system
活性污泥体系中NOB 主要包括Nitrobacter 和Nitrospira [38,52-
53].图6表明,硝化细菌群落结构
在高DO(2.0mg/L)和低DO(1.0mg/L,0.5mg/L 和0.3mgL)条件下变化较大.图4B 系统发育树显示,大多数高DO 环境中亚硝化细菌为Group3 Nitrobacter ,大多数低DO 环境中亚硝化细菌主要为Group1Nitrobacter .在高、低DO 条件下,N. winogradskyi 均为优势亚硝化细菌,这与Park 等[46]的结果不一致,他们报道低DO 下,N. moscov iensis
为优势亚硝化细菌.
当DO 从 2.0mg/L 下降到0.3mg/L 时, Nitrospira 群落结构变化不大(图7A),DO 对Nitrospira 群落结构的影响较小.在高、低DO 活性污泥体系中,Group1Nitrospira 在Nitrospira 中占比较大(图7B). 2.3 硝化细菌丰度
为研究DO 浓度变化对硝化细菌丰度的影响,利用实时PCR 分析方法对AOB 、Nitrobacter 和
6期 刘国华等：低DO 对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究 2509
Nitrospira 的特异基因进行了定量分析,结果如表3所示.当DO 从2.0mg/L 减少到0.5mg/L,AOB 的平均数量从约1.04×1012copies/L -sludge 增加到 1.12× 1012copies/L -sludge,Nitrospira 的平均数量从3.34× 1013copies/L -sludge 增加到9.86×1013copies/L - sludge, Nitrobacter 的平均数量从1.66×1010copies/L - sludge 下降到1.11×1010copies/L -sludge.然而,当DO 进一步从0.5mg/L 降至0.3mg/L 时,3种硝化细菌的平均数量均有所下降,AOB 约为6.76×1011copies/L -
sludge,Nitrospir a 约为 5.87×1013copies/L -sludge, Nitrobacter 约为3.77×109copies/L -sludge.上述实时PCR 检测结果表明,降低DO 浓度到0.5mg/L 时, AOB 和Nitrobacter 的丰度不但没有降低反而增加,而对Nitrospira 的丰度影响较大,证明一定范围内降低DO(本研究最低可降到到0.5mg/L)可使硝化细菌得到富集[14].当DO 进一步降低到约0.3mg/L 时,硝化细菌的丰度明显下降,因此DO 为0.3mg/L 时,污水中氮的去除率波动较大(图3).
A
Band 13
Nitrobacter winogradskyi Nb-255(CP000115.1) Band 15 Band 13 Band 10 Band 7 Band 6
Uncultured bacterium (JN969913.1)
Uncultured bacterium clone 26(JN969906.1)
Nitrobacter winogradskyi (KF437380.1)
Band 5Band 14Nitrobacter winogradskyi (AF344874.1)
Nitrobacter winogradskyi clone 2gb (DQ421373.1) Nitrobacter winogradskyi (KF437381.1)
Band 8 Band 9 Band 12
Nitrobacter winogradskyi (KJ023583.1) Group 1 Nitrobacter
Uncultured Nitrobacter sp. (JX020942.1) Nitrobacter alkalicus (KJ023582.1)
Nitrobacter winogradskyi (KJ023584.1) Band 18 Band 16
Nitrobacter winogradskyi (KJ023579.1)
Band 1 Band 2
Band 19Band 17 Nitrobacter winogradskyi (KJ023581.1) Group 2 Nitrobacter
Uncultured nitrite-oxidizing bacterium clone NT1c21 (KC152667.1)
Uncultured nitrite-oxidizing bacterium clone NT2c34 (KC152743.1)
Uncultured nitrite-oxidizing bacterium clone NT3c19 (KC152788.1)
Uncultured nitrite-oxidizing bacterium clone NT3SDZ4 (KC152834.1)
Band 3
Nitrobacter vulgaris (AF344875.1)
Band 4
Band 11
Group 3 Nitrobacter
6387
999199
91
55
95
53
67
78
5950
3185
5578
90
44
64
62
4850
2239
91
632270.01
B
图6 推流式活性污泥系统中硝化细菌nxr A 基因扩增产物的DGGE 图谱(A)和系统发育树(B)
Fig.6 DGGE profiling (A) for the nxr A gene amplicons and phylogenetic tree (B) of the identified Nitrobacteria in the plug -flow
activated sludge system
A
Band 1Band 2
Candidatus Nitrospira defluvii chromosom e (FP929003.1) Candidatus Nitrospira defluvii (DQ059545.1)
Nitrospira marina strain 295(HQ686084.1) Group 1 Nitrospira Nitrospira sp. (AF035813.1)
Nitrospira sp. clone o9 (AJ224042.1)
Nitrospira cf. moscoviensis SBR1024 (AF155153.1) Nitrospira cf. moscoviensi s SBR2046 (AF155155.1)
Group 2 Nitrospira
9584990.01
B
图7 推流式活性污泥系统中Nitrospira 靶向基因扩增产物的DGGE 图谱(A)和系统发育树(B)
Fig.7 DGGE profiling (A) for the Nitrospira targeting gene amplicons and phylogenetic tree (B) of the identified Nitrospira in the
plug -flow activated sludge system
2510 中国环境科学 40卷
表3硝化细菌实时PCR定量分析
Table 3 Quantitative analysis of the real-time PCR for the
nitrifiers
DO (mg/L)
AOB
(copies/L-sludge)
Nitrospira
(copies/L-sludge)
Nitrobacter
(copies/L-sludge)
2.0 (1.04±0.15)×1012(
3.34±0.49)×1013(1.66±0.18)×1010
1.0 (1.35±0.13)×1012(6.62±1.25)×1013(3.41±0.56)×1010
0.5 (1.12±0.11)×1012(9.86±0.97)×1013(1.11±0.17)×1010
0.3 (6.76±0.96)×1011(5.87±0.83)×1013(3.77±0.49)×109 2.3硝化反应的动力学系数
通过测量并计算硝化细菌的动力学参数:净增长速率(µm)、衰减速率(K d)、最大氨氧化速率(AORm)、最大亚硝酸盐氧化速率(NORm)、氨亲和常数(K NH)、亚硝酸盐亲和常数(K NO
2
)和氧亲和常数(K DO),进一步研究不同溶解氧条件下硝化细菌的动力学特性.表4所示结果表明,尽管DO从2.0mg/L降低到0.3mg/L时,硝化细菌(AOB+NOB)的净生长速率在降低,但硝化细菌的衰减率也大大降低.这一结果表明,低DO运行不会导致硝化细菌的生长显著降低,会显著延迟其衰亡,从而使低DO条件下硝化细菌功能群落得以维持.同时在低DO条件下(0.5mg/L和0.3mg/L),NOB的衰减速率低于AOB,这表明低DO条件下NOB更容易富集.
AOB和NOB的K DO、K NH和K NO2均随着DO 浓度的降低而减小,这表明AOB和NOB对氧气的亲和力、AOB对氨氮的亲和力和NOB对亚硝酸盐亲和力随着DO的降低而得以提高,进而保证了低DO条件下污泥系统的硝化能力.
表4中DO从2.0mg/L降低到0.3mg/L,AORm 和NORm的增加也证明了低DO条件的AOB和NOB比高DO条件的AOB和NOB具有更强的生存能力. Hanaki等[54]和Bellucci等[55]的研究发现DO≤0.5mg/L时培养的污泥氨氧化能力更强,但没有报道亚硝酸盐氧化能力是否增加.基于本研究的结果,DO浓度降低时系统里存在的AOB的氨氧化能力和NOB的亚硝酸盐氧化能力均得到提高.
其他研究大多认为低DO条件下AOB的富集导致氨氧化能力的提高[14,47].本研究的结果显示(图5A和表3),当DO从2.0mg/L下降到0.5mg/L,AOB 的数量和丰度变化较小,甚至当DO降到0.3mg/L 时,AOB的丰度在下降.因此,本研究中低DO条件下氨氮氧化能力的维持并非是由于AOB在低DO条件下的富集,而是由于低DO环境中AOB种群具有较强的氧和氨氮亲和力所致.然而,亚硝酸盐氧化能力的增加主要是由于NOB种群的富集(图6A和图7A),以及长期低DO条件下NOB数量和对氧、亚硝酸盐亲和力的增加.
表4低DO条件下硝化细菌的动力学特征系数
Table 4 Kinetic coefficients for the low DO nitrifying bacteria
DO=2.0mg/L DO=1.0mg/L DO=0.5mg/L DO=0.3mg/L 参数
AOB NOB AOB NOB AOB NOB AOB NOB µm (d-1) 0.390±0.05 0.282±0.023 0.205±0.042 0.290±0.039
K d (d-1) 0.215 0.293 0.203 0.292 0.139 0.108 0.121 0.093 K DO (mg/L) 0.69±0.15 0.64±0.15 0.54±0.09 0.21±0.04 0.14±0.020.08±0.02 0.08±0.0087 0.065±0.016
K NH and K NO
2
(mg/L) 1.48±0.33 2.11±0.37 1.24±0.17 2.49±0.46 0.79±0.10 1.17±0.223 0.46±0.057 0.90±0.16 AOR m, NOR m
[mg O2/(gVSS⋅h)]
4.66 4.47 4.42 6.41 6.33 8.77 7.59 9.13
3结论
3.1推流式活性污泥系统长期运行结果表明,将DO浓度从2.0mg/L降至0.3mg/L并不影响COD的去除,而当DO浓度降至0.3mg/L时,系统脱氮性能波动较大. DO浓度约为0.5mg/L时,COD、NH4+-N和TN的平均去除率分别为86.7%、98.5%和86.2%.
3.2当DO浓度从2.0mg/L降低至0.3mg/L,曝气池中的功能性细菌仍为Proteobacteria,约占细菌总数的65%. DO的减少可以富集硝化细菌(主要是Nitrospira),保证了低DO条件下的硝化效果. Nitrosomonas oligotropha 类AOB、Nitrobacter winogradskyi spp.和Group1 Nitrospira等硝化细菌是在低DO条件下执行硝化作用的主要功能群落.
3.3减少DO虽然使硝化细菌的比增长速率有所降低,但他们的衰亡时间得到了延迟,从而保证了硝
6期刘国华等：低DO对活性污泥系统碳和氮去除影响的研究 2511
化细菌的生物量.相比高DO条件,低DO条件下硝化细菌的氧、氨氮和亚硝酸盐亲和力更高,进而也可以保证低DO条件下的硝化效果.
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