一种蚯蚓体腔液蛋白的分离纯化及其生物活性

一种蚯蚓体腔液蛋白的分离纯化及其生物活性
张阳;王艳红;张华;秦学功;崔玉东
【摘要】赤子爱胜蚓体腔液含有多种蛋白并具有广泛的生物学活性,本研究采用6 V电压刺激蚯蚓分泌体腔液,通过离心、超滤分离得到蚯蚓体腔液蛋白粗品;然后将蛋白粗品经过凝胶层析和离子交换层析纯化,得到一种蚯蚓体腔液蛋白.以离子交换色谱分离到的蚯蚓体腔液蛋白样品为受试样品,紫外光谱扫描显示该蛋白在280nm 处有最大吸收峰,SDS-PAGE凝胶电泳测定其分子量约为38.6 KDa,比浊抑菌试验结果显示低浓度受试样品作用大肠杆菌1 h出现抑制效果,作用金黄色葡萄球菌3h 出现抑制效果,表明该样品具有一定抑制细菌生长的活性,此外,该蛋白还具有较强的溶解鸡红细胞的作用,溶解红细胞的最低浓度为0.39μg/mL,提示此蛋白的生物活性可能是通过破环细胞结构而实现的.%The coelomic fluid of earthworm Eisenia foetida exhibit extensively biological activity previously. Earthworm was induced by 6-Voltages electric stimulation to secrete coelomic
fluid,followed by centrifugation and ultrafiltration to obtain a crude protein mixture. The crude extracts have been purified by means of gel chromatography and anion-exchange chromatography in sequence, as resulted in obtaining a kind of pure protein. Ultraviolet analysis indicated the protein absorption wavelength 280 nm, and SDS-PAGE determined the protein molecular weight 38.6 KDa. The further bioactive study showed that the protein displayed the inhibition effects on the growth of Escherichia coli in 1 h and Staphylococcus aureus in 3 h,as well as lysis effects on chicken red cells (minimum effect concentration 0.39 μg/mL). It
suggested that activity of the protein could be come from by a means of damage-cell structure.
【期刊名称】《天然产物研究与开发》
【年(卷),期】2011(023)001
【总页数】5页(P89-93)
【关键词】蚯蚓;体腔液;分离纯化;生物活性
【作者】张阳;王艳红;张华;秦学功;崔玉东
【作者单位】黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆,163319;黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院,大庆,163319
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
Abstract:The coelomic fluid of earthworm Eisenia foetida exhibit extensively biological activity previously.Earthworm was induced by 6-Voltages electric stimulation to secrete coelomic fluid,followed by centrifugation and ultrafiltration to obtain a crude protein mixture.The crude extracts have been purified by means of gel chromatography and anion-exchange chromatography in sequence,as resulted in obtaining a kind of pure protein.Ultraviolet analysis indicated the protein absorption wavelength 280 nm,and SDS-PAGE deter mined the protein molecular
weight 38.6 KDa.The further bioactive study showed that the protein displayed the inhibition effectson the growth ofEscherichia coliin 1 h andStaphylococcus aureusin 3 h,as well as lysis effects on chicken red cells(minimum effect concentration 0.39μg/mL).It suggested that activity of the protein could be come from by a means of damage-cell structure. Key words:earthwor m;coelomic fluid;purification;biological activity
蚯蚓 (Earthwor m)属环节动物门(Annelida)寡毛刚(O ligochaeta)无脊椎动物。

蚯蚓体内含有丰富的蛋白质,这些蛋白质组成成分复杂,生物活性多样,蚯蚓蛋白类药物的研发越来越受到世界各国学者的关注。

H.Mihara从蚯蚓体内提取到一种能溶解血栓的蚯蚓纤溶酶 (Earthworm Fibrinolytic Enzyme,EFE)[1];杨嘉树从蚯蚓体内分离纯化出蚓激酶(e-PA),该酶具有溶纤和激活纤溶酶原的双重活性[2];刘堰从蚯蚓体内分离出超氧化物歧化酶(SOD),并证实其为 Cu-Zn SOD[3]。

除此以外,近年来蚯蚓溶细胞和抑菌相关蛋白的研究亦倍受关注。

Milochau从蚯蚓体液中分离到了两种分子质量为40 ku和 45 ku,具抗菌、溶血和凝血功能的蛋白质(Fetidins)[4];Beschin发现了分子质量为 42 ku,具有溶血作用的体腔细胞溶解因子(CCF-1)[5];Chao等从蚯蚓(Lum bricus rubellus)中分离得到具有广谱抗菌活性的抗菌蛋白 (Lumbricus I)[6]。

虽然对蚯蚓溶细胞和抑菌相关蛋白已经取得了积极的研究进展,但蚯蚓体腔液蛋白组成成分复杂、生物活性广泛,基础研究仍不完善。

因此,本研究在探索一种蚯蚓体腔液活性蛋白分离纯化的基础上,进一步研究其部分理化特性和生物活性,以期为此蚯蚓体腔液蛋白的基础应用研究奠定一定的基础。

蚯蚓为赤子爱胜蚓 (Eisenia fetida),日本大平二号,购自天津贾立明蚯蚓养殖场。

LabscaleTMTFF System超滤杯系统 (美国,Millpore);CR21高速低温离心机 (日本,Hitachi);AKTA Purifier100蛋白质纯化仪 (美国,GE);WF J 2100型可见分光光度计 (美国,Unico);紫外分光光度计(北京,普析通用);电泳仪 (美国,Bio-
Rad);Sephadex 75 10/300GL预装柱 (美国,GE),Q SepharoseTMFast Flow预装柱 (美国,GE)。

蚯蚓用清水洗净,过夜吐泥,再用清水洗净,吸水纸吸干,6 V电压刺激蚯蚓收集体腔液,用 1倍体积 PBS(5 mM,pH 6.8,含 1%EDTA和 1%2-巯基乙醇)溶解;4℃,15000 g 离心 30 min,收集上清,0.22μm滤膜过滤,LabscaleTMTFF System超滤系统超滤截留 5～1000 KD的样品。

选用 Superdex 75 10/300GL预装柱,缓冲液 (50 mmol/L Tris+50 mmol/L NaCl,pH 8.0)平衡 ,取超滤样品 (5～1000 KDa),上样 0.5 mL后,用缓冲液洗脱至基线,流速 1 mL/min,280 nm检测蛋白,用离心管收集各峰组分,于4℃保存备用。

阴离子交换剂Q SepharoseT M FF(7×25 mm)预装柱,用低盐缓冲液 A(50 mmol/L Tris+50 mmol/L NaCl,pH 8.0)平衡,将凝胶过滤层析分离的样品组分 (经SDS-PAGE鉴定)上样后,用缓冲液A平衡至基线,而后进行 0～100%高盐缓冲液
B(50 mmol/L Tris+1 mol/L NaCl,pH 8.0)梯度洗脱 10 mL,流速 1 mL/min,280 nm检测蛋白,用离心管收集各峰组分,于4℃保存备用。

采用考马斯亮蓝法 (Bradford)[7]测定蚯蚓体腔液蛋白 (离子交换分离 1号峰)含量,595 nm处扫描测定蛋白质浓度,以牛血清白蛋白为标准参比蛋白得标准曲线为Y=0.0071X-0.0023(R2=0.9902)。

选用标准 0.1 cm×10 cm×10 cm凝胶板,10%丙烯酰胺分离胶,5%丙烯酰胺浓缩胶,2×SDS电泳电极缓冲液进行恒流电泳,考马斯亮蓝 R-250染色,45%(V/V)甲醇:10%(V/V)冰乙酸脱色。

以标准蛋白质相对分子质量的对数 (lgMr)为纵坐标,相对迁移距离为横坐标作标准曲线。

收集培养至对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌,将其悬浮于冰浴的 PBS(5 mM,pH 6.8)中,分别测定大肠杆菌A570=0.549,金黄色葡萄球菌A570=0.550。

抑菌试管中分别加入 100 mL受试样品液 (离子交换分离 1号峰)和 3 mL菌悬液,
阴性对照管加100μL 0.9%生理盐水。

将各试管置37℃,180 r/min分别震荡培养1 h和 3 h后,转入冰浴20 min,测定 570 nm处的 A值。

取 96孔微量血凝板,1～10号孔每孔分别加入50μL血球缓冲液 (0.075 mol/L PBS,0.075 mol/L NaCl,pH 7.1)后,加入50μL受试样品液 (离子交换分离 1号峰)并与血球缓冲液混匀,倍比稀释 10个梯度,然后在每孔中分别加入50μL 2%(V/V)鸡红细胞悬液 (Als ever′s Solution保存),混匀后室温静置 2 h后观察实验结果,并设空白对照组,记录溶解鸡红细胞的最低浓度。

经超滤得到 4种不同分子量区间的蚯蚓体腔液蛋白组分,SDS-PAGE凝胶电泳见图1。

蚯蚓体腔液中 30～40 KDa之间存在大量蛋白质,C泳道的蛋白含量显著提高,说明超滤对 30～40 KDa之间蛋白质进行了浓缩。

对蚯蚓体腔液超滤样品 (5～1000 KDa)经由Superdex 75 10/300GL预装柱层析如图 2所示:得到 2个峰,其中 1号峰经 SDS-PAGE检测 (见图 5:B泳道)含有目的蛋白。

Superdex 75 10/300GL预装柱层析收集到的 1号峰组分,经由 Q SepharoseTMFF(7×25 mm)预装柱梯度洗脱见图 3所示:得到 2个峰,其中 1号峰经SDS-PAGE检测 (见图 5:C泳道)含有目的蛋白。

对 3批蚯蚓体腔液蛋白样品 (离子交换分离 1号峰),用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度分别为:0.364 mg/mL、0.354 mg/mL和 0.326 mg/mL。

受试样品 (离子交换分离 1号峰)经紫外扫描最大吸收峰位于 280 nm附近 (见图4)。

SDS-PAGE凝胶电泳检测结果 (见图 5),离子交换分离 1号峰 (见图 5:C泳道)出现单一蛋白条带,说明通过凝胶层析和离子交换层析对该蛋白进行了纯化。

根据标准蛋白迁移率计算得到方程:Y=-0.9398X +2.2731,R2=0.9704,根据方程计算得到受试样品 (离子交换分离 1号峰)成分分子量约为 38.6 KDa(见图 5:C泳道)。

比浊法应用受试样品为离子交换分离 1号峰,抑菌试验 (见表 1)结果显示,受试样品作用大肠杆菌 1 h时出现抑制效果,作用 3 h时抑制效果消失。

受试样品作用金黄色葡萄球菌 1 h时未抑制效果,作用 3 h时出现抑制效果。

表明该样品具有一定抑制细菌生长的活性,但作用不同的细菌时效性有差异。

溶解鸡红细胞试验应用受试样品为离子交换分离 1号峰,鸡红细胞溶解试验 (见表 2)结果:该蛋白质对鸡红细胞具有明显的溶解作用,溶解鸡红细胞的最低蛋白浓度为0.39μg/mL。

蚯蚓生活于腐殖质环境中,其受外界刺激通过体表背孔分泌的体腔液是抵御微生物(细菌、病毒、真菌等)侵害的天然屏障,该体腔液含有多种蛋白质组分 (溶菌酶、凝集素、抗原结合蛋白、抗菌蛋白MPII等)[8-11]。

王冲等从蚯蚓组织和体腔液中分离到多种多肽组分,发现这些多肽对细菌、真菌、癌细胞和病毒有不同程度的杀伤作用[12]。

本研究以蚯蚓体腔液为研究对象,采用 6 V电压瞬时刺激蚯蚓获得了大量黄色粘稠状体腔液,物理刺激蚯蚓可快速大量获得蚯蚓体腔液并减少化学物质刺激对蚯蚓蛋白的分离纯化带来的影响;蚯蚓体腔液经离心、超滤后通过紫外光谱分析最大吸收波长为 280 nm附近,说明其主要成分为蛋白质。

我们进一步应用凝胶层析和离子交换层析纯化蚯蚓体腔液蛋白,收集到两个主要蛋白成分峰,通过 SDS-PAGE分析峰蛋白成分,显示离子交换分离 1号峰分子量约为 38.6 KDa。

Sven Langedeng研究发现,蚯蚓体腔液中含有一种分子量约为 38 KDa的膜穿孔蛋白 (Eiseniapore),其具有破坏非自身细胞膜结构的能力,从而推测该蛋白为蚯蚓免疫系统的重要组成部分[13]。

蚯蚓体腔液还具有溶血、凝血作用和抑菌作
用,Valembois等曾报道了蚯蚓体腔液中的溶血蛋白和抑菌蛋白为同一种脂蛋白[14]。

目前已经报道蚯蚓体内含有多种抑菌蛋白组分,张希春从蚯蚓体组织中分离纯化到两种分子量小于 1 KDa的抗菌肽,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均具有抑菌活性[15]。

刘艳琴从蚯蚓组织匀浆液中分离纯化到一种含有 5个氨基酸
残基的抗菌肽,其对绿脓杆菌具有明显的抑制作用[16]。

在总结蚯蚓体腔液蛋白研究成果的基础上,采用比浊法对分离纯化到的蚯蚓体腔液蛋白的抑菌活性做进一步研究,发现低浓度的蚯蚓体腔液蛋白 (离子交换分离 1号峰)样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制效果,从时效性上看,对大肠杆菌的抑制效果出现时间要早,而对金黄色葡萄球菌的抑制效果出现时间较晚。

蚯蚓体腔液蛋白 (离子交换分离 1号峰)样品溶解鸡细胞试验发现该蛋白还有显著的溶解鸡红细胞的作用,最低蛋白浓度为0.39μg/mL,提示该蚯蚓体腔液蛋白作用机理可能是通过破环细胞结构实现的。

【相关文献】
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