米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定

实验报告
课程名称：农产品检测与农化分析实验指导老师：金崇伟成绩：__________________ 实验名称：米粉中粗蛋白含量和油菜籽中脂肪含量的测定 同组学生姓名：余慧珍
一、实验目的和要求 二、实验内容和原理
三、实验材料与试剂四、实验器材与仪器 五、操作方法和实验步骤六、实验数据记录和处理
七、实验结果与分析八、讨论、心得 一、 实验目的和要求
1. 掌握米粉中粗蛋白含量的测定方法——半微量消煮蒸馏法；
2. 了解凯氏定氮法与其他测定方法的区别；
3. 掌握油料作物粗脂肪的测定方法，熟悉与掌握重量分析的基本操作；
4. 了解实验中粗脂肪测定所采用的方法和优缺点。

二、 实验内容和原理 1. 米粉中粗蛋白测定意义 米粉是我国目前消费量和消耗大米量最大的大米深加工产品,但目前国内米粉生产技术较低，米粉品质尤其是粗蛋白含量随产品变异较大，因此米粉中粗蛋白的测定对米粉标准化、工业化、规范化生产具有重要意义[1]。

2. 粗蛋白测定——硫酸过氧化氢-半微量蒸馏法 2.1 待测液制备——硫酸-过氧化氢消化法 浓硫酸是一种强氧化剂，也是一种脱水剂，在反应过程中还起到升温的作用。

过氧化氢是一种氧化剂。

米粉在浓H 2SO 4溶液中，历经脱水炭化、氧化等一系列作用，而氧化剂H 2O 2在热浓H 2SO 4溶液中分解出的新生态氧具有强烈的氧化作用，分解H 2SO 4没有破坏的有机物和碳。

使有机氮转化为硫酸铵盐，该消煮液可用半微量蒸馏法定氮[2]。

反应过程：NH 2-R-COOH + H 2SO 4→nCO 2 +SO 2+H 2O+NH 3； 2NH 3 + H 2SO 4 → (NH 4)2SO 4。

2.2 粗蛋白含量测定——半微量蒸馏法 消煮液中的硫酸铵经强碱（如30%-40%的氢氧化钠）碱化使之分解放出暗器，利用蒸汽将氨气蒸至硼酸溶液中被吸收，氨与硼酸溶液中的氢离子结合生成铵根离子，使溶液中的氢离子浓度下降。

用标准酸液滴定，利用标准酸液消耗体积及其浓度可计算得到标准酸液消耗量，对应反应方程可计算求出NH 4+含量，进一步求出米粉粗蛋白含量[2]。

1) 蒸馏过程： (NH 4)2SO 4 + 2NaOH → Na 2SO 4 +2NH 3↑+2H 2O 2) 吸收过程： NH 3²H 2O + H 2BO 3→NH 3²H 2BO 3+ H 2O 3) 滴定过程： 2NH 3²H 2BO 3+ H 2SO 4→(NH 4)2SO 4+ 2H 2BO 3。

2.3粗蛋白含量计算公式
粗蛋白含量（%）= (V - V 0)×c×14×10-3×ts×K×100 m
其中，V ——样品测定所消耗1/2H 2SO 4的体积（mL ）；
V 0——空白试验所消耗的1/2H 2SO 4的体积（mL ）；
c ——标准的1/2H 2SO 4浓度(mol/L)；
14——氮原子的摩尔质量（g/mol ）；
10-3——mL 换算为L ；
ts ——分取倍数，本实验为ts=10；
m ——样品质量（g ，干基）；
K ——氮换算成蛋白质的系数，本实验为K=5.95。

3.粗脂肪测定意义
脂肪是粮食、油料中的重要化学成分。

测定粮食、油料中的粗脂肪含量，对评定其可食部品质和营养价值具有重要意义。

对油料作物如油菜、花生等而言，含油量的高低直接体现了其经济价值；同时含油量高低又是确定油料等级的重要依据[3]。

本实验中提取的脂肪性物质为脂肪类物质的混合物，其中含有脂肪游离脂肪酸、磷脂\酯、固醇、芳香油某些色素及有机酸等，称为粗脂肪。

4.油菜粗脂肪含量测定——残余重量法
4.1残余重量法
本实验采用重量法，对提取前的样品和用脂肪溶剂提起后的脂肪进行称量，通过质量差值计算油脂含量，该法适用于固体和液体样品。

通常将样品浸于脂肪溶剂，为乙醚或沸点30℃至60℃的石油醚，借助于索氏提取器（图1）进行循环抽提[2]
：
4.2粗脂肪含量计算公式
粗脂肪含量（%）=（m 1+m 2-m 3）/m 2³ 100%
其中，m 1----滤纸的质量(g)；
m 2 ----滤纸及烘干样品的质量(g)；
m 3 ----浸提后的滤纸及残渣的质量(g)。

三、 实验器材与仪器
1． 样品
市售米粉；油菜籽；
2.试剂
乙醚或石油醚、浓
H 2SO 4（密度1.84g/mL ）溶液、H 2O 2溶液、NaOH 溶液、甲基红（含乙醇）-
溴甲酚绿混合指示剂、H 3BO 3指示剂、（1/2 H 2SO 4）
标准液；
3.器材
2.1 粗蛋白测定
万分之一分析天平、消煮炉、消煮管、半微量定氮蒸馏装置、半微量滴定管（5mL ）、锥形瓶、容量瓶、移液管、洗耳球；
图1 索氏提取器
2.2 粗脂肪测定
万分之一分析天平、高温鼓风烘箱、称量瓶、药匙、滤纸、分析天平、毛玻璃板、脱脂棉、索氏提取器。

四、操作方法和实验步骤
1.米粉中粗蛋白含量测定
1.1待测液制备
1.2半微量蒸馏法测定
2.油菜中粗脂肪含量测定
2.2样品抽提测定
五、实验数据记录和处理
表1 米粉中粗蛋白含量的测定
样品质量m(g) 滴定后体积
V(ml)
滴定前体积
V0(ml)
稀释倍数
ts
换算系数
K
硫酸浓度
c(mol/L)
米粉中粗蛋白
含量（%）
实验组0.2506 1.980 0.02 10 5.95 0.0103 4.79 注：米粉中粗蛋白计算公式含量（%）= (V - V0)³c³14³10-3³ts³K³100
m
表2 油菜中粗脂肪含量的测定
滤纸质量m1(g)
滤纸及烘干
样品质量m2(g)
浸提后滤纸及
残渣质量m3(g)
油菜籽中粗脂肪
含量（%）
实验组0.5956 1.6233 1.5958 38.38
注：油菜籽中粗脂肪计算公式含量（%）=（m1+m2-m3）/m2³ 100%
六、实验结果与分析
1. 米粉中粗蛋白含量的测定
本次实验根据GB 50095-2010测定得到米粉中粗蛋白含量为4.79%。

据报道[1]，一般市售米粉的粗蛋白含量范围为 5.4~7.8%。

比较可得，本组测定值较低；而与同一时间测定的其他组比较，其他组测定得粗蛋白含量在4%~6%之间。

比较可得，本组测定值较为正常。

可能原因是操作误差与米粉品质差异，其中影响米粉粗蛋白的影响因素有原大米蛋白质含量、加工中糊化程度、浸泡中浸泡液pH和离子强度、制粉中干磨强度等[5]。

而实验中误差可能原因与改进如下：
1.1 误差
实验中误差的可能原因有：
1) 本组在将米粉移如消煮管中，有少许粘附在侧壁上，导致之后的消煮始终无法将在粘附在最上端的米粉溶下，而导致消煮所得待测液中NH4+浓度较低，从而使得粗蛋白测定结果偏低；
2) 蒸馏过程中，如NaOH未加过量、蒸馏装置接头处有漏气导致NH3溢出，或蒸馏时间不够（本次蒸馏终点仅以锥形瓶中溶液达到50mL为标准），由此导致的NH3未完全被吸收均会导致粗蛋白测定结果偏低；
3）由于是实验操作考试，本实验未设空白对照组，因此在计算结果时，除加加入米粉之外，消煮前引入的含氮化合物，以及消煮后蒸馏滴定阶段引入的NH4+或NH3均会使得实验结果测定值偏高，本实验中该影响程度不可确定；
4）本实验消煮过程开始阶段，消煮温度仅为150℃，远未大浓硫酸微沸的温度。

此时过早加入过氧化氢会使得消煮温度始终无法达到理论值；此外，消煮时间过短，反复取放消煮管造成消煮不充分也会使得消煮不完全。

这是本实验中粗蛋白含量较低的主要误差来源。

5）蒸馏速度过快，或者加热温度过高，碱液容易被蒸汽带出至锥形瓶，导致测定结果偏高；且蒸馏结束拔出入口玻璃塞过快时，会使碱液倒喷入冷凝管，亦导致结果偏高[6]。

1.2 改进
针对以上误差分析，可通过以下方法加以改进：
1）往消煮管中加入大米时，宜使用长纸条缓慢送入到硬质试管底部，尽量减少粉末粘在壁上，
影响样品的消煮。

2）消煮过程中应留意消煮温度，调节加热温度在200~250℃，保证充分的消煮时间。

且H2O2滴加第一次不可过早，尽量在等到达到浓硫酸微沸后一段时间再加入，且滴加时需直接滴入瓶底溶液中，避免滴在瓶壁上，否则H2O2会因高温快速分解，失去氧化效果。

3）蒸馏过程中NH4+在碱性条件下释放出氨，为防止样液中氨气逸出，在检查好装置气密性的前提下1）加入氢氧化钠溶液需过量；2）缩短待测液的滴加时间，因为操作时间越长，从加入口溢出的NH3越多，使得测定结果越小；3）水封；4）夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽。

4）蒸馏过程中为确定蒸馏是否完毕可在液体即将蒸馏完毕时，打开玻璃塞口，用蒸馏水润湿的洁净红色石蕊试纸检验蒸汽中是否存在NH3。

此过程操作亦需快速完成。

若试纸变红，则说明蒸馏未结束，反之，则可终止蒸馏过程。

5）定容和滴定时，需等溶液充分冷却至室温后方可进行，否则由于温度的变化会影响定容的准确性和滴定终点的判断。

6）所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制，且在转移待测液时尽量避免氨氮的污染。

2. 食品中粗脂肪含量的测定
本次实验根据GB 5490-1985测定得到油菜籽中脂肪含量为38.38%，油菜籽中油脂的含量为37.5%~46.3%，且根据油菜的类型不同其油脂含量略有不同[8]。

对比可得，本实验测定值在正常范围之内，且与同一时间其他组测定值较为接近。

由于本实验中，索氏提取器部分有助教代为操作完成，因此以下分析可能的误差原因，实际状况尚未可知。

2.1 误差
实验中误差原因可能有以下几点：
1) 烘干样品吸水。

经过索氏提取器对油脂进行提取后的纸包要进行烘干，但因烘干与称量时间相隔较久，且当天环境中相对湿度较大，滤纸与油菜籽等吸水导致测定结果偏低；
2) 提取不完全。

多个样品共同提取时，部分脂肪物质没有提取完全，因而导致实验结果偏低：
3）烘干冷却时间不一致。

且时间过长时，不饱和脂肪酸会因受热氧化而增加质量，导致测定结果偏高[9]。

2.2 改进
1）称量油菜籽样品之后，迅速包好滤纸，加入索氏提取器；或缩短烘干与称量的时间，减少其吸水带来的误差；
2）增加单个滤纸包内油菜籽质量，同时单个索氏提取器内加入样品数量，且滤纸包需在保证油菜籽不外漏的前提下，使得乙醚提取液能与其充分接触，提高脂肪提取率；
3）保证烘干冷却时间一致，且烘干时间不宜过长。

七、讨论、心得
问题1 粗蛋白含量测定方法之间的比较？
目前，粗蛋白的方法主要以传统蒸馏滴定法和仪器自动检测法为主。

下面将就强碱直接蒸馏法、双氧水法（本实验采用）、凯氏定氮仪法进行比较。

先简要介绍强碱直接蒸馏法和凯氏定氮仪法原理与操作步骤。

1.1强碱直接蒸馏法[10]
强碱直接蒸馏法是间接测定粗蛋白质的一种简便的方法。

其将样品在强碱中消煮，使饲料中的α-氨基、酰氨基以及某些特殊基团上的氮素在强碱的作用下以氨的形式释放出来，直接蒸馏到硼酸中，再用盐酸溶液来滴定，根据盐酸消耗量来计算出DD法所测得的表观含氮量。

计算公式与双氧水法类似。

1.2凯氏定氮仪法[11]
BuchiK-370 全自动凯氏定氮仪，其将样品在催化剂与硫酸加入后，置于红外线消化炉上消煮，后用全自动凯氏定氮仪进行蒸馏滴定。

即放入已消化好的样品，用pH6.86和4.00两种标准液校正后，即可自动蒸馏、滴定。

并可根据仪器给出的标准酸消耗量进行计算。

1.3三种方法比较
强碱直接蒸馏法与双氧水法比较，偏差比自动定氮仪打但均在国际法两个平行样品测定允许误差范围之内。

强碱直接蒸馏法分析速度快，消煮与蒸馏同步进行，节省时间，但缺点是蒸馏时对操作控制较为严格，稍有不慎蒸馏物亦产生泡沫状，不易与氨气的挥发。

双氧水法与凯氏定氮仪法比较如下表1[11]，对比看出BuchiK-370全自动凯氏定氮仪与半微量蒸馏法测定8组不同浓度饲料中的粗蛋白含量的最大相对偏差为0.51%，平均相对标准差为0.16%。

比较两种方法，1）全自动定氮仪红外辐射加热只需要90~120min，大大缩短消化时间，节省电能；而半微量蒸馏法消煮时间通常在3~5h；2）全自动定氮仪减少人为操作误差，通过电极判断的滴定终点优于人肉眼判断变色；3）全自动定氮仪减少转移冷却定容等步骤，避免环境中氨对样品污染导致的误差，而半微量蒸馏法并不能消除这种误差[11]。

但针对不同粗蛋白含量的样品，需采用不同的称样量（如表1右），且若装置气密性不加，会到使得样品吸出导致测定结果不准确，且该仪器成本较大，不适合研究实验操作。

综上，与半微量蒸馏法相比，强碱直接蒸馏法用强碱消煮与蒸馏效果略逊，但准确度尚可，适用实际生产检测所用；而凯氏定氮仪法（自动）虽然省时节能，操作更为精确，但成本高，且不适于锻炼实验操作技能。

综合考虑后，半微量蒸馏法是用于科研教学实验的最佳方法。

问题2油料脂肪测定方法之间的比较？
目前，国内外测定粗脂肪的方法有十余种之多，而抽提法是常用的脂肪测定方法。

其中，索氏抽提法(Soxhlet extractor method)为脂肪含量测定的经典方法。

下面就索氏抽提浸泡法及阿贝折射仪法与索氏抽提法（本实验采用）作比较。

索氏抽提法根据GB 5490-1985，索氏抽提浸泡法及阿贝折射仪法的操作步骤如下[3]。

2.1索氏抽提浸泡法
用烘盒称取2 g~5 g 样品，于105 ℃左右烘箱中烘30 min，趁热倒入研钵中研细，用滤纸包扎好样品，放入抽提筒内, 加入乙醚，虹吸一次, 再加入乙醚使滤纸包浸泡在乙醚中，浸泡8 h~12 h(过夜)，然后抽提至抽提筒内的乙醚用玻片做点滴实验无油迹为止(约1 h~2 h)。

抽净脂肪后, 取出滤纸
包，加热回收溶剂。

将抽提瓶中的乙醚挥干，置于105 ℃烘箱，烘90 min 后再烘30 min 至恒重，抽提瓶增重的质量即为脂肪的质量。

脂肪含量计算类似于本实验中计算公式。

2.2阿贝折射仪法
称取研细后的均匀样品5.00 g~10.00 g，置于小烧杯中，加入10 g~15 g 无水Na2SO4，用玻棒搅拌，以吸干水分。

精确加入有机溶剂(α-溴代萘)5 ml~10 ml，用研棒充分研磨使脂肪溶出，静置数分钟后，将浆状物转入有滤纸的漏斗中过滤，取滤液1~2 滴，用阿贝折射仪测定混合液的折射率。

式中，V———加入溶剂量(ml)；
ρ———20 ℃时脂肪的密度(一般取0.92 g/ml，亦可根据所用油脂的种类查得或实测，因温差1 ℃时校正值为0.00064 ，故可不校正)；
m———样品的质量(g)；
n———纯溶剂的折射率(α-溴代萘为 1.6582 , 八角茴香油为 1.5503 , 二碘乙烯为
1.742 , 亦可根据实际所用溶剂测定)；
n1———混合液的折射率；
n2———油脂的折射率。

2.3三种方法比较
表中[3]对比可以看出，后两方法与
GB 5497-1985所得结果，绝对偏差平均
值为0.04%，相对偏差平均值为0.018%，
均为达到显著性差异水平，这说明两种发
发测定结果较为准确。

其中，索氏抽提浸泡法测定结果与国
标法相比有负偏差，这主要是在浸泡过程
中没有对流充分，使得脂肪大部分只能溶
解在乙醚，从而影响下一步测定。

但国标
法对抽提瓶要求高，在测定前需达到恒重，
操作中亦需防治污染且在烘干脂肪时常
常因脂肪氧化后质量增加而使得恒重难
以实现，且工作效率较低，而索氏抽提浸
泡法只需1~2h即可完成，这在实验教学
和实际生产检测中较为实用。

而阿贝折射仪法测定的相对偏差平均值为0.002 %。

阿贝折射仪法克服了国标等其他索氏抽提法耗时长的缺点，具有方便、快速等优点，是粮食、油料收购部门可选用的方法。

此方法主要是依据脂肪溶于有机溶剂的特性，选择某种比脂肪有较高折射率的有机溶剂，通过研磨使样品中的脂肪溶解出来。

之所以阿贝折射仪法相对偏差较大时由于研磨中细度、时间、温度对会影响测定准确度，而这些方面因为人为操作差异变异性较大。

研磨时间过长、温度过高，α-溴代萘就会挥发损失，
使测定结果产生偏差，同时研磨细度直接影响到脂肪溶出的速度和溶出率[12]。

综上，以上两种方法与国标法相比，相对偏差平均值均小于0.002 %。

索氏抽提浸泡法可以缩短抽提时间，提高抽提效率，适用于科研教学实验操作；而阿贝折射仪法具有方便快速的特点，更能适应油料收购部门检测。

参考文献
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