WATERS液相色谱教程三四七最全PPT课件

溶剂瓶盘
注射器箱门 柱温箱
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溶剂配比单元 进入门
2695排气操作示意图
▪面板操作 :
–打开状态(Statas)画 面 –按右下角Direct
Function功能键 –选 Dry Pime或
Wet Prime命令 –选OK
即可进行泵的排气
▪注:
–当流路中充满空气时,
按图示做Dry Prime
psi
5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
500 0 10.0
20.0
Pressure vs. Temperature
30.0
40.0 Degrees, C
50.0
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
50% MeOH 50 % ACN 100% H2O 100% MeOH 100% ACN
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
mL/min
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反压与温度的关系
▪温度对反压的影响是反比关系 ▪温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些
• 一次性使用的膜“Cartridge”
• 使用方便简单，交叉污染小 • 有更小内径，可用于微量样品的处理
▪ 高速离心
• 大于：10,000rpm
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超滤
▪ 机理
• 超滤是一种基于分子量分离的技术
▪ 目的
• 根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份 • 除去小分子样品中的大分子蛋白 • 脱盐
60.0
70.0
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影响系统反压的其它因素
▪反压与色谱柱长度成正比 ▪反压与填料颗粒度的平方成反比
–2.5μm填料比3.5μm填料反压高 ▪反压与管路直径的四次方成反比 (1/D4) ▪反压与管路的长度成正比
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色谱泵的运行
▪ 排气后的色谱泵即可用于实验运行
• 注意∶
MeOH ACN
20
40
60
80
100
Percent Organic Solvent
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反压与流速的关系
▪流速对反压的影响是线性关系 ▪流速增加，反压亦增大 ▪下图的实验条件：
–2.1×30mm Symmetry C18柱,20℃
psi
5000 4500 4000 3500
Pressure vs. Flow Rate at 20?C
Waters 515 泵的前面 板
▪ 电源开关 ▪ 柱塞杆清洗孔
▪ 排液阀
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泵控制器
柱塞杆 清洗孔
泵体
Waters 600泵的前面板
电源开关 排液阀
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泵灌注阀
Waters 2695 分离单元
检测器接液盘
前面板显示 屏和键盘
软盘驱动器
样品室门
溶剂输送单 元进入门
• 排气后，先设流速为 0 • 恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱 • 如需要，恢复排气时断开的控制线
▪ 根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值 ▪ 若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过
渡(包括排气操作)
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色谱泵的维护保养
▪ 流动相要过滤 ▪ 常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用
▪ 高速离心取上清液 ▪ 过滤、超滤 ▪ 选择性沉淀 ▪ 衍生反应 ▪ 液-液萃取 ▪ 固相提取(Solid Phase Extract,SPE )
– Oasis和Sep-Pak固相提取小柱
▪ 其它
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去除微粒的方法
▪ 过滤
• 过滤膜/过滤装置
• 有机滤膜(≤0.5 µ m)/水溶性滤膜(≤0.45 µ m) • 膜片可更换
▪ 改变分离的选择性
• 改变组份的基团，如：
• 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离
▪ 典型的例子
• 柱前衍生氨基酸分析
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AccQ-Tag 衍生法
H
O
N
O
N
１°及２°氨基酸
N
O
半衰期＜1秒
O
AQC衍生试剂
H20 半衰期约15秒
N
6-氨基喹啉
NH2 HO
O
+N
+
O
N-羟基琥珀酰亚胺
启动液相色谱仪器的流 程
▪ 开启HPLC系统各个设备的电源 – 打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算 机，启动色谱管理软件
▪ 准备流动相 – 过滤,脱气
▪ 色谱泵排气 – 用新配制的流动相灌注泵
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启动液相色谱仪器的流 程
▪ 用准备好的流动相平衡色谱系统
– 可在泵的控制面板上设定流速参数(15×5泵需在
并与填料相匹配
• 缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8) 内
• 缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM) • 流动相对样品的溶解度
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液相色谱对流动相的要求
▪ 液相色谱仪器对流动相的要求∶
• 与检测器匹配 • 脱气 • 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统） • 溶剂的粘度 • 防止细菌的生长
– 在清洗步骤完成后进行钝化处理 – 确认清洗用的磷酸已基本洗净 – 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 用6M硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)45分
钟 – 换成清水洗至出第口24水页/共p1H41显页 中性
实验样品的制备
▪ 标样和样品
– 标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析 的参 考标准物,一般是纯度较高的纯物质
混匀 ▪ 清洗步骤如下:
– 取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测 器
– 用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为25%) – 用30%磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)45分
钟
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色谱泵及系统的钝化
▪ 钝化液用6M硝酸水溶液 ▪ 6M硝酸的配制:取浓硝酸40ml与60ml水混匀 ▪ 钝化步骤如下:
–流动相的溶剂组成 –温度 –流速
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反压与溶剂组成的关系
▪流动相的粘度是产生反压的主要原因 ▪有机溶剂－水的粘度随组成而改变 ▪其压力随组成变化如下图所示
psi
1600 1400 1200 1000
800 600 400 200
0 0
Pressure vs. Organic-Water Percentage
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
1星期
1天 新鲜配制
0
5
10
15
20
25分第9页/来自141页色谱泵的排气操作
▪ 色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如 有气体要按以下步骤排气：
• 可保持连续脱气第6，页/共多14用1页于低压梯度
流动相的保存
▪ 有机溶剂流动相:
• 室温下密封,避光保存
▪ 缓冲盐流动相:
• 当日现配现用 • 低温下密封保存,一般不超过3天 • 防止微生物生长
▪ 有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:
• 低温密封保存 • 防止有机相的挥发
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保存于聚乙烯瓶中的超纯
▪ 亲水-亲脂平衡共聚物
N
O
亲水性单体∶ N-乙烯基吡咯烷酮
亲脂性单体∶ 二乙烯基苯
“亲水”
–使填料具有水可浸润性质 –降低与水的接触角
“亲脂”
–提供对被分析物质的反
相保留能力
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样品预处理的通用SPE方 法
▪ 这是适合于分析众
多基质中大多数样品的 通用操作步骤
▪ 建议首先使用这种
– 样品:待测物,一般是成分复杂的混合物
▪ 液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:
• 必须能溶于流动相
• 如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样 品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱
• 样品溶液要过滤除去微粒及杂质 第25页/共141页
复杂样品的预处理
▪ 样品预处理的目的
–除去微粒 –减少干扰杂质 –浓缩微量的组份 –提高检测的灵敏度及选择性 –改善分离的效果 –有利于保护色谱柱及仪器
软件控制下操作)
– 系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作
▪ 准备样品
– 用流动相溶样或重组样品
▪ 编制仪器方法,开始实验
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液相色谱对流动相的要求
▪ 色谱柱对流动相的要求
• 过滤除去微粒 • 纯度的要求
• 超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水 • 有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，
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选择性沉淀
▪ 常用于生化样品中除蛋白
• 有机溶剂 • 乙腈，甲醇
• 强酸 • 三氯乙酸，高氯酸
•盐
• 50% 硫酸铵 • 10% TCA(三氯乙酸钠)
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样品衍生
▪ 提高检测的灵敏度
• 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 • 增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器
流动相脱气的方法
▪ 加热
• 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但 容易造成流动相组成的变化
▪ 抽真空
• 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效 果
▪ 超声波振荡
• 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1 分钟左右即可)
▪ 通惰性气体（一般用氦气）
• 可保持在线连续脱气，多用于低压梯度
▪ 在线脱气机 （in-line degasser)
水
测试条件 水样: 40ml trace enrichment @ 2.0 ml/min 色谱柱: C18 反相柱 (Waters) 梯度: 线性 100% 水－ 100% 乙腈 波长: 254 nm
2 星期
1 星期
1天
1 小时 新鲜配制
0
5
10
15
20
25
分
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保存于棕色玻璃瓶中的超纯 水
▪ 一般采用30％磷酸水溶液作为清洗剂，用6M 硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化
▪ 清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢 ▪ 钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑
均匀的氧化膜
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色谱泵及系统的清洗
▪ 清洗液用30%磷酸水溶液 ▪ 30%磷酸配制:取85%浓磷酸35ml与65ml水
–若只是更新流动相时,
只须作Wet Prime
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关于色谱系统的反压
▪什么是反压(back pressure)
–流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,
又称系统反压或系统压力
–Waters习惯用的压力单位是Psi(磅/平方英吋) –其它单位有:Bar,Mpa
▪影响系统反压的主要因素:
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流动相的脱气
▪ 流动相脱气的目的
• 使色谱泵的输液准确
• 输液量均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高
• 提高检测的性能
• 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低
• 保护色谱柱
• 减少死体积 • 防止填料的氧化
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样品预处理的重要性
是影响实验成败的决定性步骤
▪ 占样品分析时间的比例最大
• 样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间
▪ 占分析消耗总成本的比重最大
• 消耗大量的溶剂及其它化学品
▪ 对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节
• 影响实验结果好坏的最重要因素
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样品预处理常用的方法
水冲洗柱塞杆清洗孔 ▪ 关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为
准 ▪ 更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如
不互溶，要用一种中间溶剂过渡 ▪ 色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用
纯甲醇充满泵头及第管21页路/共1,4并1页 保存在纯甲醇中
液相色谱系统的清洗与钝 化
▪ 色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和 检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理
通用的操作步骤
▪ 如果需要进一步降
低干扰物的影响，可使 用二维SPE方法 ▪ 注:此方法于规格为
3 cc,60mg 的 Oasis®HLB 小柱上开发
制备样品
活化/平衡
1ml 甲醇/1ml 水
上样
多至 200 ml 样品
冲洗废弃物
1ml 5% 甲醇/水溶液
洗脱想要的化合物
1ml 甲醇
• 将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中 • 打开泵及在线脱气机电源开关 • 将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路 • 设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续
流出
• 必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动 相
• 对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进 第10页/共141页
CO2
H R1
NN R2
N
O
衍生后的氨基酸
+
HO
O
N
O
N-羟基琥珀酰亚胺
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浓缩样品
▪ 目的：富集微量或痕量组份 ▪ 浓缩样品的方法
• 萃取/吹干 • 沉淀/再溶解 • 色谱法 • 固相提取
• Oasis小柱 • Sep-Pak小柱
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Oasis HLB固相提取小 柱