蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解完整ppt课件
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第十节
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
第六章第1节《蛋白质的提取和分离》ppt-中图版选修1PPT课件
2.卵清蛋白质的分离 选取鸡、鸭、鹅、鹌鹑等动物的新鲜_卵__清__做 实验材料。采用__电__泳__法分离卵清蛋白质。
想一想 可否利用蛋白质的提取与分离技术快速诊断 早期癌变？ 【提示】 可以。只需从早期患者的尿液、 血液或细胞裂解液中提取少量蛋白质样品,采 用蛋白质指纹图谱技术，就可以更加快速、 简便、准确地对细胞癌变作出诊断。
例1 关于电泳的说法不正确的是( ) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁 移的过程 B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极 移动 C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少 D．用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的 电泳迁移率完全取决于分子的大小
【解析】 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁 移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的 大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白 质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大 超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖 了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移 率完全取决于分子的大小。
2.电泳 3. 染 色 ： 用 质 量 分 数 为 0.05% 的 _考__马__斯__亮__蓝__R__25_0_染色液对凝胶进行染色。 4.脱色：用体积分数为7%的__醋__酸__溶__液__对凝 胶板进行浸泡漂洗数次，直至底色脱净。 5.制干胶板：将已_脱__色__的凝胶板放在_保__存__液_ 中浸泡3 h～4 h后，放在两层透气的_玻__璃__纸__ 中间自然干燥。
________________________________________ ________________________________________ ___________________________________。
3.结果分析 (1)不同蛋白质的混合溶液，在经过同一个电 场电泳后，会在凝胶上形成不同的带纹，每 一种带纹可能就是一种蛋白质。 (2)如果要对每一条带纹作进一步的研究，只 需将带纹剪下，分别予以洗脱，然后对洗脱 液中的蛋白质做进一步分离。
蛋白质的分离和纯化精品课件
( A)
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
最新 PPT
34
2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
最新 PPT
40
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
最新 PPT
41
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
最新 PPT
50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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18
三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
最新 PPT
19
1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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40
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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18
三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质的分离与纯化技术(2007-2008).ppt
除盐的方法：常用的是透析，此外也可用葡萄糖凝胶G-25或
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
28
等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
31
(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
18
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
19
细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
2020/12/22
2
一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2020/12/22
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等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力 最小，因而溶解度也最小。
各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节 溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉 淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结 合用。
因此有机溶剂的加入使水溶液的介电常数降低，蛋白质分子 表面可解离基团的离子化程度减弱，水化程度降低，促进了 蛋白质分子的聚集和沉淀。
有机溶剂引起蛋白质沉淀的另一重要方式可能与盐析相似， 与蛋白质直接争夺水化水，致使蛋白质聚集而沉淀。
2020/12/22
31
(3) 细分级分离 (fine fractionation)
2020/12/22
18
如果所要的蛋白质主要集中在某一细胞组分，如细胞 核、染色体、核糖体或可溶性的细胞质等，则可利用 差速离心方法将它们分开
如果碰上所要蛋白质是与细胞膜或膜质细胞
器结合的，则必须利用超声波或去污剂使膜结构
解聚，然后用适当的介质提取。
2020/12/22
19
细胞破碎方法总结
2020/12/22
蛋白质的分离与纯化技术(20072纯化的目的 二． 蛋白质分离纯化的依据（蛋白质的特
性） 三． 蛋白质稳定存在的影响因素 四． 蛋白质分离纯化的一般程序 五． 蛋白质的分离纯化方法 六． 浓缩、干燥及保存
2020/12/22
2
一、蛋白质分离纯化的目的
研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理
2020/12/22
4
蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分 子中保留着游离的末端α—氨基和α—羧 基以及侧链上的各种功能团。蛋白质也 是一类两性电解质，能和酸或碱发生作 用。可解离基团主要来自侧链上的功能 团。
第六章-蛋白质的分离、纯化PPT课件
a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
17
2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
3
• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
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2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
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沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
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③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
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• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
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二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互 摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动 物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法）
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物
将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范 围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
.
值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
第三组组员：
生化实验设计
——蛋白质主的讲提人取： 与分离纯化
华中师范大学化学学院
.
已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点 3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 C加热 3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。
.
四、精细纯化
金属螯合亲和层析
固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面 的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行 蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电 子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在 溶液中会被水分子或阴离子占据。
钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端 有两个Ca2+ 结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+ , 这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+ ,钙调蛋白与 Ca2+ 结合后的构型相当稳定 。
.
玻璃匀浆机
.
b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
.
三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
.
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
.
.
.
五、分析鉴定
A、定性分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋 白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了 原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时，蛋白质 分子的迁移速度取决于分子大小。
.
文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基
酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之 间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一 定的高温，在90oC加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合 后可以暴露出它的疏水基团。
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整个实验过程一般可分为 5 个阶段：
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三、蛋白质粗提取
步骤原：理：利用蛋白质在PH等电点时的溶 1．解向度试最管小中加，入因磷而酸会氢以二沉钠淀和柠的檬方酸式，析使出其。PH=4。 2．试将剂提：取柠的溶檬液酸加、入磷到酸第氢1步二骤钠所配的缓冲液中。
3．静置一段时间，待沉淀完全。 4．过滤或离心出粗产品。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。
①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需 进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等电 点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 等）⑤分析鉴定。
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实验步骤：
一、材料的选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取的组织用4℃预
冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再 用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲 液）。
二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互 摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动 物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法）
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物
将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范 围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
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值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
第三组组员：
生化实验设计
——蛋白质主的讲提人取： 与分离纯化
华中师范大学化学学院
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已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点 3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 C加热 3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。
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四、精细纯化
金属螯合亲和层析
固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面 的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行 蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电 子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在 溶液中会被水分子或阴离子占据。
钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端 有两个Ca2+ 结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+ , 这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+ ,钙调蛋白与 Ca2+ 结合后的构型相当稳定 。
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玻璃匀浆机
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b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
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三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
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五、分析鉴定
A、定性分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋 白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了 原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时，蛋白质 分子的迁移速度取决于分子大小。
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文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基
酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之 间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一 定的高温，在90oC加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合 后可以暴露出它的疏水基团。
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整个实验过程一般可分为 5 个阶段：
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三、蛋白质粗提取
步骤原：理：利用蛋白质在PH等电点时的溶 1．解向度试最管小中加，入因磷而酸会氢以二沉钠淀和柠的檬方酸式，析使出其。PH=4。 2．试将剂提：取柠的溶檬液酸加、入磷到酸第氢1步二骤钠所配的缓冲液中。
3．静置一段时间，待沉淀完全。 4．过滤或离心出粗产品。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。
①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需 进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等电 点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 等）⑤分析鉴定。
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实验步骤：
一、材料的选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取的组织用4℃预
冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再 用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲 液）。