机器视觉流感疫苗血凝素含量测量实验研究

机器视觉流感疫苗血凝素含量测量实验研究
景文博;王光腾;祝勇;付强;王晓曼;姜会林
【摘要】流感疫苗血凝素含量的测量,采用单向放射免疫扩散法,其关键在于扩散环直径的确定.传统采用游标卡尺或高清扫描图像方法测量扩散环直径,存在人为干扰,测量精度与稳定度低.本文基于机器视觉技术研制了血凝素含量自动测量仪,利用CCD相机采集扩散环图像,用图像处理算法测量扩散环直径,实现了扩散环直径数据获取、血凝素含量计算与结果数据分析等操作的自动化与智能化,有效消除人为干扰,提高测量精度.实验表明,该测量仪测量精度可达2 μg/mL,相关参数R2>0.99,稳定度高,变异系数小于1%,满足实际测量需求.此仪器适应于各种型别的流感疫苗血凝素含量测量,且测量结果易于保存、传榆,便于二次处理.
【期刊名称】《光电工程》
【年(卷),期】2010(037)011
【总页数】6页(P78-83)
【关键词】机器视觉;血凝素含量;单向免疫扩散;扩散环检测
【作者】景文博;王光腾;祝勇;付强;王晓曼;姜会林
【作者单位】长春理工大学,长春,130022;长春理工大学,长春,130022;长春理工大学,长春,130022;长春理工大学,长春,130022;长春理工大学,长春,130022;长春理工大学,长春,130022
【正文语种】中文
【中图分类】TP391%R373.1+3
0 引言
血凝素是流感病毒颗粒表面的主要抗原，是流感疫苗中有效的免疫物质[1]，是疫苗质量控制中重要的一项，因此准确地测定血凝素的含量与控制流感疫苗的质量有着密切的关系。

国际卫生组织要求采用单向放射免疫扩散法(Single Radial Immunodiffusion，SRID)测定血凝素含量[2]，原理是抗原的浓度与扩散环的面积(直径的平方)成正比，其关键在于扩散环直径的确定。

传统的采用游标卡尺或高清扫描图像方法测量扩散环直径[3-7]，都受人为主观因素影响，测量精度、稳定性低，不能全面、准确地反映疫苗质量。

本文采用机器视觉技术[8-9]对流感疫苗血凝素含量进行全自动高精度测量，实现了扩散环图像获取、扩散环直径测量、标准回归曲线绘制、待测品浓度计算、实验数据分析等操作的自动化与智能化，可有效减少测量误差。

文中阐述了该方法的核心技术，重点研究了扩散环图像采集与直径检测的软件和硬件设计原理以及实现过程，并通过实验验证此方法的精确性。

迄今为止，基于机器视觉流感疫苗血凝素含量的自动测量与分析系统尚未见报道。

此系统的研制成功将为国内流感疫苗质量的检测做出突出的贡献，具有十分重要的实用价值。

1 测量原理
SRID原理[5]为在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色扩散环，其直径的平方或面积与抗原浓度成正相关，且与打孔器直径无关[1-2]。

同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即获取浓度与扩散环直径平方或面积的关系曲线，进而可以定量检测未知标本的抗原浓度。

采用SRID方法测血凝素含量，首先制备血清琼脂板，打孔。

将标准品(浓度已知)
及待检样品经裂解剂处理后稀释成不同稀释度，加入相应孔中扩散，经染色、脱色后测量扩散环直径，绘制出标准品线性回归曲线 baxy += (x为扩散环直径平方，y为血凝素含量)，进而计算待测品血凝素含量。

扩散环直径测量精度决定了血凝素含量测量的精度。

运用机器视觉技术及相关图像处理算法可快速、准确测量扩散环直径，且无人为误差，重复性高，结果便于分析、保存。

2 系统构成
血凝素含量自动测量系统包括图像获取、图像处理与数据分析、自动控制三大功能模块，其具体的结构框图及各部分名称如图1所示。

光源、光学系统、CCD相机、计算机及图像处理与数据分析软件组成了该系统的
机器视觉部分[7]，主要完成扩散环图像的获取功能，同时通过控制指令与控制盒
结合，完成对光源、自动托盘的控制，调整待测玻片成像的亮度、对比度，保证图像质量。

图像处理与数据分析软件对采集到的图像进行分析检测，计算血凝素含量。

扩散环图像质量影响测量结果精度。

流感疫苗血凝素含量自动测量仪采用工业CCD相机，相机接收采用自动变倍率滤光衰减系统，实现对外界杂散光进行消除。

考虑到玻片的透射与镜面反射特性，且测试玻片基色为蓝色，光源采用红色面型背投式光源，保证了图像的高亮度与高对比度。

图像处理与数据分析软件是该系统的核心，按功能可分为扩散环图像获取、图像处理、血凝素含量自动计算三部分。

图像获取部分进行系统硬件配置、扩散环图像采集；图像处理对采集到的扩散环图像进行预处理、圆检测等操作，获取扩散环直径数据；血凝素含量自动计算部分完成标准回归曲线生成与绘制、待测品浓度计算等，并对结果进行输出、保存。

图1 血凝素含量自动测量系统框图Fig.1 Block diagram of automatic measuring
3 工作流程
运用SRID原理测量血凝素含量，测量时先检测标准品扩散环直径，利用曲线拟合算法，得到标准线性回归曲线，然后将待测品扩散环的测量值代入标准回归曲线，求出待测品浓度。

具体的工作流程框图如图2所示，自动测量仪工作流程主要分为五个环节：
1) 玻片放置：将血凝素玻片放于自动托盘上。

2) 系统设置：包括相机设置、光源调节，保证获得便于后续处理的高质量图像。

3) 图像获取：获取高质量扩散环图像。

4) 图像处理：包括图像预处理、边缘检测、精密圆检测，获取扩散环直径数据。

5) 数据处理：依据标准品的测量数据，利用稳健拟合获得标准回归曲线，继而测待测品浓度。

最后进行数据分析，生成实验报表。

图2 血凝素含量自动测量仪的基本工作流程Fig.2 Workflow of automatic measuring instrument for HA content
扩散环检测是整个测量过程的关键与难点，其结果直接影响血凝素浓度测量结果的精度。

4 扩散环检测
要进行扩散环检测，首先要获得一幅质量较好的扩散环图像，然后再利用一定的图像处理算法精确检测出圆的各项参数[7-8]，包括圆心、半径等。

图3为扩散环检测的算法框图。

图像预处理可以有效清除图像采集过程中由光照不均匀、杂质干扰等带来的图像噪声，便于后续图像分析。

采用直方图均衡化可以增强图像对比度，增加图像像素灰度值的动态范围。

用中值滤波可有效消除孤立点噪声。

边缘是指图像局部强度变化最显著的部分，主要存在于目标与目标、目标与背景、区域与区域之间，是图像分析和理解的第一步。

Canny边缘检测算子是最常用、
最经典的一种边缘检测算子[12]，可提取单像素边缘且定位准确，误判率低，能有效抑制虚假边缘。

圆检测是本系统测量浓度的核心。

常用的圆检测方法为Hough变换[9-12]。

Hough变换计算精确度高，对噪生不敏感，不仅可同时检测圆形及同心圆环，而且还可以检测部分圆弧和残缺圆。

因此采用Hough变换能够准确计算出玻璃平皿上扩散环的扩散圈的直径。

经典的Hough变换计算量大，占用内存多，不适合实际测量操作。

引进基于梯度信息的快速Hough变换，节省内存的同时可以大大提高运算速度。

图3 扩散环检测算法框图Fig.3 Algorithm block diagram of proliferation ring detection
5 实验结果
根据前面的设计，已研制出样机一台，实物图如图4所示。

此仪器相机采用德国Basler数字相机，焦距25 mm，像元尺寸10 µm，分辨率为1 392×1 040。

经标定，相机测量精度为Δd=0.144 9 mm/pixel，浓度精度为ΔC′=0.093 48 (µg/mL)/pixel，采用亚像素 10 细分，浓度精度达：ΔC=ΔC′/10=0.009 348 (µg/mL)。

现做两组实验，用以验证该仪器的测量精度与稳定度。

实验一是对同一玻璃平皿上的3个型别血凝素(H1N1，H3N2，B)扩散环进行测量，分别使用游标卡尺和检测仪进行。

实验二利用83 µg/mL的H1N1标准样品稀释出30 µg/mL试样，分别对其用游标卡尺和检测仪进行六次测量。

实验玻片由长春生物制品研究所提供。

标准抗体、标准抗原来源世界卫生组织NIBSC。

图4 流感疫苗血凝素含量测量仪实物图Fig.4 Photo of measuring instrument 图5 扩散环图像Fig.5 Image of proliferation ring detection
5.1 测试精度实验
现分别用游标卡尺和本仪器对扩散环进行测量，游标卡尺是直接对玻片进行测量。

图5(a)所示为本仪器采集的扩散环图像，图5(b)为圆检测的结果图像。

数据中：
为溶液浓度和扩散环测量直径相关系数的平方值，该值越接近1表明标准溶液采样越准确，拟合样品溶液测量精度越高。

用游标卡尺测量的结果数据如表1，表2。

图6为游标卡尺测量标准品回归曲线。

表1 游标卡尺测量的标准品数据Table 1 Standard sample data by vernier caliperClass No. Diameter/mm Concentration/(μg/mL)Recursive line 1 7.9 83 14 7.15 62.25 7 5.95 41.5 23 5.1 20.75 3 7.5 67 26 6.9 50.25 13 5.6 33.5 25 4.5 16.75 2 7.6 73 5 6.85 54.25 16 5.95 36.5 24 4.7 18.25 H1Ny=1.646x-20.15 R2=0.991 H3Ny=1.331x-9.874 R2=0.987 B y=1.531x-16.6 R2=0.997 表2 游标卡尺测量的测试品数据Table 2 Data of sample for measuring by vernier c aliperClass No. Diameter/mm Concentration/(μg/mL)11 6.82 56.41 19 6.38 46.85 17 5.88 36.76 20 5.80 35.22 10 5.80 34.90 18 5.25 26.81 15 5.30 27.51 21 5.25 26.81 9 5.85 35.79 8 5.65 32.27 12 5.75 34.02 14 5.45 28.87 H1N1 H3N2 B
表3 测量仪测量的标准品数据Table 3 Standard sample data by measuring instrumentClass No. Diameter/mm /(μg/mL)1 7.80 83 4 7.13 62.25 7 6.02 41.5 23 5.12 20.75 3 7.30 67 6 6.70 50.25 13 5.80 33.5 25 4.70 16.75 2 7.50 73 5 6.80 54.25 16 5.90 36.5 24 4.80 18.25 ConcentrationRecursive line
H1N1y=1.741x -23.91 R2=0.994 H3N2y=1.589x-19.28 R2=0.994 B
y=1.636x-20.08 R2=0.998
表4 测量仪测量的测试品数据Table 4 Data of sample for measuring by measuring instrumentClass No. Diameter/mm Concentration/(μg/mL)11
6.05 39.81 H1N119 5.57 30.10 17 5.35 25.92 20 5.30 24.99 10 6.00 3
7.92
H3N218 5.50 28.75 15 5.60 30.55 21 5.30 25.36 9 5.90 36.15 B 8 5.50 28.69 12 5.70 32.35 14 5.40 26.91
用本仪器测量的结果数据如表3，表4。

图7为测量仪测量标准品回归曲线。

表5 标准品测量数据Table 5 Standard sample dataMethods Diameter/mm Concentration/(μg/mL)Recursive line 9.14 83 Vernier cal iper 8.00 62.25 6.88 41.5 6.00 20.75 8.87 83 8.08 62.25 6.89 41.5 6.11 20.75 y=1.285x-22.31 R2=0.986 Measuring instrument y=1.448x-30.96 R2=0.990
表6 被测品6次测量结果Table 6 Data of sample for measuring by 6 timesMethods No. Diameter/mm Concentration/(μg/mL)Error/(μg/mL)1 6.60 33.66 3.66 Vernier caliper 2 6.45 31.15 1.15 3 6.30 28.69 -1.31 4 6.65 34.52 4.52 5 6.50 31.98 1.98 6 6.25 27.89 -2.11 1 6.45 29.28 -0.72 2 6.43 28.91 -1.09 3 6.44 29.02 -0.98 4 6.45 29.28 -0.72 5 6.45 29.28 -0.72 6 6.42 28.95 -1.05 Measuring instrument CV/%8.43 0.61
图6 游标卡尺测量标准品回归曲线Fig.6 Linear regression curve of standard sample by vernier caliper
图7 测量仪测量标准品回归曲线Fig.7 Linear regression curve of standard sample by measuring instrument
5.2 测试稳定性实验
实验二对30 μg/mL的H1N1样品进行六次重复测量，采用变异系数来评价仪器的稳定性能，变异系数定义为：CV=σ/μ，其中σ为测试样品的标准差，μ为测试样品的均值。

测量结果如表5、表6所示。

由实验数据可以看出：
1) 本仪器测量精度可达2 µg/mL，相关参数R2＞0.99，测量精度完全满足生产质
量检测的要求，且明显优于游标卡尺手动测量法。

2) 本仪器稳定精度远远高于利用游标卡尺进行的测量稳定度，变异系数为0.61%，小于1%。

6 结论
反复实验结果表明，测量仪测量精度可达2 µg/mL，测量稳定度高，可有效满足
测量要求，全面准确地反映疫苗质量。

基于机器视觉的流感疫苗血凝素含量自动测量系统具有自动化测量、智能优化提取、亚像素图像边缘检测、无干扰图像识别、图像综合分析与处理等优点。

且相对于手动、半自动测量，该系统更加精确、高效、快捷，克服了人为因素引起误差，为流感疫苗生产质量提供依据，具有重要的社会意义。

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