视神经部分损伤后视网膜基质细胞衍生因子-1α表达的变化

视神经部分损伤后视网膜基质细胞衍生因子-1α表达的变化潘栋超;毕永延;冯东福;陈二涛;楚胜华;汪洋
【摘要】目的研究大鼠视神经部分损伤后视网膜基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)的表达变化.方法制作大鼠视神经部分损伤模型,于损伤后1、2、3、5、7、10、14 d收集视网膜组织,采用酶联免疫吸附法和实时荧光定量PCR分别测定损伤组(n=28)、假手术组(n=28)和正常对照组(n=12)大鼠视网膜组织中的SDF-1α蛋白及mRNA的表达.结果视神经损伤后各时间点,损伤组视网膜组织中SDF-1α蛋白和mRNA的表达较假手术组及正常对照组均明显升高(P<0.01),均在损伤后第5天出现峰值.伤后14 d,损伤组视网膜组织中SDF-1α蛋白及mRNA仍维持在高表达状态.结论视神经部分损伤后SDF-1α在视网膜中的表达出现上调,并可在较长时间内维持高表达.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2009(029)012
【总页数】4页(P1424-1427)
【关键词】视神经损伤;视网膜;基质细胞衍生因子-1α
【作者】潘栋超;毕永延;冯东福;陈二涛;楚胜华;汪洋
【作者单位】上海交通大学,医学院第三人民医院神经外科,上海,201900;上海交通大学,医学院第三人民医院神经外科,上海,201900;上海交通大学,医学院第三人民医院神经外科创伤医学研究所,上海,201900;上海交通大学,医学院第三人民医院神经外科,上海,201900;上海交通大学,医学院第三人民医院神经外科创伤医学研究所,上海,201900;复旦大学,上海医学院,上海,200032
【正文语种】中文
【中图分类】R774.6
视神经由视网膜神经节细胞的轴突和少突胶质细胞组成，损伤后常导致严重的视觉障碍甚至失明，现有治疗方法的效果尚不理想。

近年来，细胞替代治疗，特别是干细胞治疗的发展为视神经损伤修复带来了新的希望[1]。

但对于移植的细胞来说，如何准确迁移至需要修复的区域是实现有效修复的重要环节[2]。

视网膜基质细胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor 1α, SDF-1α)最早在小鼠骨髓基质细胞分泌的细胞因子中被发现，属于CXC趋化因子超家族，在介导炎症反应、造血干细胞迁移及归巢、肿瘤的浸润转移等方面具有重要作用[3-6]。

近年来，有研究[7]发现在脑缺血损伤后，梗死灶局部组织出现SDF-1α表达的上调。

但视神经部分损伤后，视网膜组织是否存在SDF-1α表达的变化，目前尚未见报道。

在本研究中，利用既往建立的大鼠标准化视神经损伤模型[8]，研究了视神经部分损伤后SDF-1α在视网膜组织中的表达情况。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物：6周龄清洁级雌性SD大鼠(180～190 g)68只，购自复旦大学实验动物科学部，动物生产许可证号为SCXK(沪)2007-0002,使用许可证号为SYXK(沪)2007-0002。

随机选取12只大鼠为正常对照组，其余随机分为损伤组(n=28)和假手术组(n=28)。

1.1.2 试剂及仪器：眼科手术显微镜(NSKLTD)，酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(R&D)，7900HT型高通量荧光定量PCR 仪 (Applied Biosystems)，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis
Kit(Fermentans), SYBRRPremix Ex Taq TM(TakaRa)。

1.2 视神经损伤模型的建立 10%水合氯醛腹腔注射(35 mg/kg)麻醉大鼠，将其俯
卧位固定于眼科显微镜下，依据已经建立的方法[8]制作右侧视神经部分损伤模型。

假手术组动物仅提起右眼球结膜剪开约6 mm，钝性向下向后分离结膜下组织，
暴露视神经9 s后即复位眼球。

1.3 视网膜组织标本的收集
1.3.1 ELISA标本：在损伤后1、2、3、5、7、10、14 d分别收集视网膜标本。

将动物麻醉后快速取下整个眼球并置于一次性培养皿中，迅速将培养皿放入超净台中，在肉眼直视下用显微剪刀紧贴角—巩膜缘的巩膜侧，将角膜及边缘巩膜完整
剪下。

利用显微弯镊将玻璃体尽量完整取出，然后将弯镊探入视网膜和巩膜的间隙，钝性轻柔地将整个边缘剥离后，便可将整个视网膜完整取下。

取下的视网膜迅速放入编号的离心管中，封口并置于-80 ℃冰箱中保存。

正常对照组标本一次性收集完成。

1.3.2 Real-time PCR标本：按照上述操作取下眼球后将其放入灭活RNAse的培
养皿中，在超净台中取出视网膜后，将组织放入灭活RNAse的离心管中，封口并置于-80 ℃保存。

正常对照组标本一次性收集完成。

1.4 ELISA法检测SDF-1α蛋白集中取出标本，测组织重量。

制备冷Lysis Buffer，每毫升中加入5 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和5 μL 的100 mmol/L PMSF，混匀，冰上保存数分钟待用。

在离心管中加入的冷 Lysis Buffer，每100 mg组织加入0.5 mL，然后用研磨棒将组织磨成匀浆，整个过程保持低温操作。

将离心管以3 000 r/min离心3 min，取上清待测。

采用双抗体夹心ELISA法检
测上清液中SDF-1α，除以组织重量后得出不同组织单位重量中的SDF-1α含量，进行比较分析。

实验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 一步法提取总RNA 采用TRIzol试剂，按一步法提取总RNA。

称取标本0.1 g，
在液氮中磨碎，取盛有1 mL TRIzol的离心管，将磨碎的标本放入其中，用一次
性1 mL注射器反复吹打，并于4 ℃、12 000 r/min离心5 min。

取上清，加入
氯仿0.2 mL，室温下充分振荡混匀，静置10～15 min后再次4 ℃、12 000
r/min离心15 min。

取上清，加异丙醇0.5 mL，混匀后置于-70 ℃冰箱中15～
30 min，取出于4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取白色沉淀。

加入75%的乙
醇1 mL，置于离心管中，轻柔振荡，待沉淀悬浮后于4 ℃、12 000 r/min离心
10 min，弃上清，在室温下风干。

取50 μL的DEPC水，将沉淀溶解后即得到总RNA，置于-80 ℃冰箱保存。

紫外分光光度计检测提取的总RNA，
D260/D280>1.8，且用溴化乙啶染色后28 S和18 S条带清晰并呈2∶1时即可
用于后续实验。

1.6 cDNA第一链的逆转录合成取抽提的RNA各2 μg，采用两步法逆转录。

先
加入1 μL OligoDT，再加入DEPC水，调整至终体积13.5 L后于65 ℃反应15 min；分别加入5×RT缓冲液4 μL、dNTP 0.5 μL、Rnasin 1 μL、M-MLV逆转
录酶1 μL，置于37 ℃条件下反应60 min。

收集逆转录产物，置于-20 ℃保存，
将其稀释2倍后进行Real-time PCR。

cDNA放置-80 ℃冰箱保存。

1.7 Real-time PCR 依据Primer Express软件 (Applied Biosystems)，采用的引
物序列见表1。

引物通过Blast进行特异性分析。

目的基因上游引物和下游引物各0.15 μL (β-actin上游、下游引物各0．15 μL)，cDNA 4.85 μL，SYBR Green PCR master mix 5 μL，反应总体积10 L。

采用3复孔法以检测结果稳定性。

反
应条件：50 ℃ 维持2 min后加热至95 ℃，维持10 min；然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min，共循环40次。

循环阈值(cycle threshold，Ct) 由PCR反应曲线采集，
采用△△Ct法对原始Ct值进行相对定量。

校正公式：Fold induction=2-△△Ct，公式中△△Ct=[Ct目的基因(未知样品)-Ctβ-actin (未知样品)]-[Ct目的基因(校正样品)-Ctβ-actin(校正样品)]，校正样品是可以代表1倍的目的基因表达量的物质。

各组mRNA同内参基因相比得到相对表达量。

所得实验结果为独立测得的3次数据。

表 1 Real-time PCR寡核苷酸引物序列Tab 1 Oligonucleotide primers used for Real-time
PCRGeneSequenceSDF⁃1αForward5⁃GATTCTTTGAGAGCCATGTCGC⁃3Rever se5⁃AGTCCTTTGGGCTGTTGTGCTT⁃3β⁃actinForward5⁃CCTCTATGCCAACAC AGTGC⁃3Reverse5⁃GTACTCCTGCTTGCTGATCC⁃3
1.8 统计学方法采用SPSS 11.0软件进行统计学分析。

所得计量数据均以表示。

各个时间点的结果采用t检验进行组间比较，组内不同时间点数据的比较采用单因素方差分析。

组内数据先行方差齐性检验，方差齐性者进行比较，方差不齐者采用成组秩和检验法。

P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1 视网膜组织SDF-1α蛋白的ELISA检测在各个时间点，损伤组大鼠视网膜组织中SDF-1α蛋白较正常对照组和假手术组均出现上调(P<0.01)。

损伤组的峰值出现在损伤后第5天，伤后14 d仍保持较高水平(图1)。

假手术组各时间点SDF-1α蛋白的质量浓度比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

图 1 SDF-1α蛋白在视网膜组织中的表达Fig 1 Expression of SDF-1α protein in retinas
①P<0.01 vs normal control group and sham operated group, ②P<0.05 vs other time points of injury group
2.2 SDF-1α mRNA的Real-time PCR检测正常对照组SDF-1α mRNA的相对表达量为0.003 04±0.000 85;在损伤后各个时间点，损伤组视网膜组织中SDF-1α mRNA的表达量均较假手术组和正常对照组明显升高(P<0.01)，峰值出现于损伤后第5天(P<0.01)(图2)；第14天虽然表达水平升高，但第10天与第14天的
差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

图 2 Real-time PCR检测视网膜组织中SDF-1α mRNA的表达
Fig 2 Expression of SDF-1α mRNA in retinas detected by Real-time PCR
表 2 损伤组和假手术组视网膜组织中SDF-1α mRNA的相对表达量Tab 2 Relative expression of SDF-1α mRNA in retinas in injury group and sham operated
group(±s)GroupTimeaf terinjury(d)123571014Shamoperated0．00281±0．000170．00261±0．000080．00680±0．000500．00333±0．000430．004 75±0．000290．00246±0．001020．00519±0．00336Injury0．02709±0．004000．00887±0．000490．04107±0．013990．05736±0．005950．033 95±0．001530．02616±0．001100．03755±0．00152
3 讨论
研究[9]发现,视神经损伤后外源性神经干细胞可以向视网膜深层定向迁移并与宿主
视网膜结构整合。

但诱导干细胞进行定向迁移的原因较复杂，目前尚未完全清楚。

有研究[10]发现,SDF-1α/CXCR4信号转导通路是中枢神经系统损伤后神经前体细胞发生靶向性迁移的重要信号转导通路。

在本研究中，我们发现视神经损伤后视网膜组织SDF-1α mRNA及蛋白的表达在损伤后24 h即出现明显升高，且在伤后
14 d内持续维持高表达。

假手术组SDF-1α mRNA在第14天的表达量出现升高
趋势,可能与后期球后损伤导致的炎症刺激有关，该因素可能也介导了损伤组SDF-1α mRNA在这一时间点表达量的升高；但该时间点的蛋白表达量未有明显改变。

Bar-Ilan等[11]研究发现视神经损伤后，在视神经以及视网膜组织内催化花生四烯酸代谢形成血栓素A2、前列环素等多种活性物质，引发血管收缩、痉挛和闭塞，导致继发性的组织缺血缺氧损伤。

其次，损伤引发的自由基释放造成生物膜的损伤，破坏细胞膜生物屏障功能，引起细胞内物质释放，溶酶体膜受损释放出水解酶。

在
中枢神经系统的研究[12-14]中已经证实，这些因素引发的局部非感染性炎症反应将激活胶质/小胶质细胞并刺激内皮细胞，激活的胶质/小胶质细胞以及内皮细胞则会上调SDF-1α的分泌；而在视神经损伤研究中尚未见明确报道。

本实验结果显示损伤组视网膜SDF-1α表达的峰值出现在第5～7天，之后缓慢下降，但是直到第14天仍然明显高于假手术组以及正常对照组，该结果同Fleming等[14]观察到的中枢神经系统损伤后小胶质细胞的聚集高峰一致。

此外,Dezawa等[15]在视神经损伤的研究中也发现，小胶质细胞在损伤后第7天阳性表达水平明显升高。

而Lima e Silva等[16]进一步在视网膜缺氧研究中发现SDF-1α定位在激活的胶质细胞上，结合本研究结果显示的SDF-1α表达的时间趋势以及峰值出现的时间，可推测视神经单纯机械性损伤后SDF-1α的高表达可能与胶质细胞激活聚集密切相关，并且视觉系统内SDF-1α的上调机制同中枢神经系统具有很高的相似性。

视神经损伤导致视网膜神经节细胞轴突的原发或继发性断裂，而SDF-1α可以促进中枢神经系统轴突再生。

Opatz等[17]发现，外源性SDF-1α的干预足以克服中枢神经系统髓磷脂抑制轴突再生的作用。

Chalasani等[18-19]在研究中发现，炎症激活的胶质细胞同时表达神经生长导向因子Slit-2和SDF-1α，体外实验中观察到Slit-2对视网膜神经节细胞的生长锥有强大的诱导塌陷效应，而SDF-1α在视网膜组织中能降低Slit-2的这种作用。

本实验研究了SDF-1α在视网膜组织损伤后上调的时间规律，结果显示其同中枢神经系统损伤后的SDF-1α表达情况相似，说明视神经—视网膜系统可作为研究中枢神经系统病变的平台；而视网膜内SDF-1α峰值出现的时间区间同炎症、胶质细胞激活高峰的一致性，则提示其在视网膜组织自我修复机制中同多种修复途径之间存在重要协同作用，可能发挥了桥接枢纽的功能。

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