工具酶和基因载体
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(1)具有复制起点，能携带外源DNA片段进入受体细胞，进行稳定
的DNA自我/同步复制
(2)具有标记基因
(3) 具有若干限制酶的单一识别位点
(4) 具有较高的外源DNA的载装能力
常见的基因工程载体
包括质粒载体、 噬菌体类载体等。
(1)质粒载体
质粒的一般生物学特性
质粒DNA
质粒DNA的复制类型
质粒载体的构建及重要的质粒载体
(2)DNA连接酶
• DNA连接酶的定义
能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。该 酶催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成 磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。
OH PBiblioteka 5‘…G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C…5’
弛型）。
2.质粒载体的构建及重要的质粒载体
(1)重组体分子的转化存在三种可能性
(1)没有转化进宿主细胞
(2)质粒发生自身环化，没有重组成功（空载质粒） (3)重组成功（重组质粒）
无抗性 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之外
无抗性
有抗性 有抗性
质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之内
有抗性
无抗性
克隆位点
克隆位点
碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化
• 平末端DNA片段的连接
基因克隆实验中，常用的平末端DNA片段的连接法，主要有同聚物加尾法、接头连 接法等。
(1)同聚物加尾法
同聚物加尾法是利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是， 利用末端脱氧核苷酸转移酶（能够在无模板链的情况下，将核苷酸加到DNA分子单链延 伸末端的3‘-OH基团上）转移核苷酸的特殊功能。
HindIII对双链DNA分子的切割作用
• II型限制性内切酶的主要用途
(1) 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切割的DNA片段。
对于核苷酸序列已知的DNA分子，可利用此法直接分离目的基因。 (2) 建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱
(a)
B E H BH EH BE
M
3 kb 2kb 1.5 kb 1 kb 500 b
(b)
B B
1.7
3 .3
1.7
E
B
1.6 1.4 0.3
B
E E H H B H B
1.7 0.5 1.2 0.9
E
2.0 3.5 3.5 3.0
B
0.6
B H B B B H
E E
2.3
H
1.5 1.5
E
H
B B
1.0
B
E
H
3.3
限制的遗传信息，贮存在可以 长期保存的稳定的重组体中，以备需要时随时能够应用。这种保存基因组以便重组DNA。
质粒DNA的复制类型
根据寄主细胞所含拷贝数的多少，可将质粒分成两个不同的复制型：
一种是低拷贝数的质粒（1-3份拷贝），称为“严密型”复制控制的质粒；
另一种是高拷贝数的质粒（10-60份拷贝)，称为“松弛型”复制控制的质 粒。
拷贝数的常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所
含有的质粒DNA分子的数目。 有的文献定义为每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子的数目。 一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的，还受到寄主的 控制。例如，R1质粒 大肠杆菌寄主（严密型）、奇异变型杆菌寄主（松
OH P DNA连接酶
5‘…G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’
DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即双链DNA上的 某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而 不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形 成的单链断裂。
• 基因工程中常用的DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶：是它的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。 PCR反应过程中需将模板DNA置于高温下变性、解链，而耐热DNA聚合酶 在靶DNA变性的高温下仍能保持活性，因而在PCR过程中只需一次性加入 反应系统即可，简化了操作过程。 目前有于PCR的耐热DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Pwo DNA 聚合酶和Tth DNA聚合酶等。
(3)重要的质粒载体
为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗
药性的选择记号，又具有低分子量、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复
制功能的多种限制酶单酶切位点等优点的新的质粒载体。
pBR322质粒载体
酵母2m质粒
pBR322质粒载体
构建pBR322质粒的关键性步骤是，通过体内易位或体外重组加入可
应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段
(2)接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特 殊的双链寡核苷酸短片段。
人工接头连接
(3)DNA聚合酶
• DNA聚合酶的定义
具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。这类酶的特点在于，能够把 脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。 DNA聚合酶作用时大多都需要模板，合成产物的序列与模板互补。
• II型限制性内切酶的识别序列
限制性内切酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。 多数限制酶的识别序列由6个核苷酸对组成。 如常用的限制酶EcoRI、HindIII和BamHI的识别序列分别是 GAATTC AAGCTT GGATCC CTTAAG 、 TTCGAA、 CCTAGG。 少数限制酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成，或者由多于6个核苷酸对组成。 如Sau3A的识别序列是GATC MaeIII的识别序列是GTNAC CTAG， CANTG。
天然质粒用作克隆载体的局限性
重要的质粒载体
质粒DNA
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。
绝大多数是质粒都是由环形双链DNA分子组成的复制子。
环形双链的质粒DNA分具有三种不同 的构型：
共价闭合环形DNA(SC)、开环DNA (OC)和线形DNA(L)。
质粒DNA的分子构型
• 反转录酶：催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应，又称依赖RNA 的DNA聚合酶。 反转录酶是分子生物学中最重要的核酸酶之一。以mRNA模板合成 cDNA，是其最主要的用途。
反转录酶的5‘￫3’方向的DNA聚合酶活性
都齐全了，能够在试管中切割或连接DNA了
4.2 基因工程载体
理想的基因工程载体应具备的特征
限制性内切酶识别序列的共同规律：呈回文结构，即序列被正读和反 读是一样的。 为了便于书写，识别序列可以以5‘￫3’走向的单链DNA表示。例如， 识别序列5‘AAGCTT 3’就可以写成 3‘TTCGAA 5’ AAGCTT。 有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。例如，AccI既可识别 GTATAC，又可识别GTCGAC。
• 常用的DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7 DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶和反转录 酶等。 到目前为止，已从大肠杆菌中纯化出了三种不同类型的DNA聚合酶，即大肠杆菌 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能 是参与DNA的修复过程，而DNA聚合酶III的主要功能与DNA的复制有关。
• DNA连接酶的种类
目前常用的DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连
接。
T4连接酶可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双 链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间的连接效率比较低。
• DNA连接酶的连接作用
质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 …
4.1 基因工程的工具酶 （1）限制性内切酶
• • • • • 限制性内切酶的定义和分类 II型限制性内切酶的命名 II型限制性内切酶的识别序列 II型限制性内切酶的酶切位点 II型限制性内切酶的的主要用途
• 限制性内切酶的定义
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使 每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3‘-OH基团和5’-P基团的 DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 至今发现的限制性内切酶有三种类型，各具特性，基因工程操作中真 正有用的是II型酶。
• • • • • •
一、基因研究的发展过程 二、DNA的组成、结构和功能 三、基因工程的概念及主要内容 四、工具酶和基因载体 五、基因工程的基本技术 六、基因工程在食品产业中的应用
四、工具酶和基因载体
• 4.1 基因工程的工具酶
限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 …
• 4.2 基因工程载体
无抗性 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之外 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之内
无抗性 有两种抗性 有一种抗性
有两种抗性 有两种抗性
抗菌素抗性基因
抗菌素抗性基因
克隆位点 克隆位点
(2) 天然质粒用作克隆载体的局限性
天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 例如：天然质粒pSC101 特点：只有一个四环素抗性选择标记(Tetr)，三个基因插入失活克隆位点和一个其它 克隆位点(EcoRI)。 缺点：分子量较大(9.1 kb)，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因（无法使用插入 失活技术选择重组体分子）
选择的抗药性记号，同时设法除去非必要的区段（亲本质粒DNA上一些对
基因克隆无关紧要的DNA片段，及对DNA克隆无用的限制酶识别位点）， 以降低分子量。
pBR322质粒三个不同来源的组成部分
pBR322质粒的优点 具有较小的分子量(4.36 kb)； 具有两种抗菌素抗性基因 可供作转化子的选择记号； 具有较高的拷贝数
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质 粒DNA具有不同的电泳迁移率。走在最前沿的是 scDNA，其后依次是LDNA和ocDNA。
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
不同质粒DNA分子量差异显著，小的不到1 kb，大的超过500 kb，多 数在10 kb。 标准的质粒命名，通常用一个小写的p来代表质粒，而用一些英文缩 写或数字来对这个质粒进行描述。例如，pBR322，BR代表研究出这个质 粒的研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的头一个字母，322是实验编号。
• II型限制性内切酶的酶切位点
DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开 的位置被称为酶切位点，可用￬表示。 限制酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如G ￬GATCC、 AT ￬CGAT等。少数在两侧，如￬GATC、 CATG￬等。
DNA分子经限制性内切酶酶切产生的DNA片段末端，因所用限制酶不 同而不同。
质粒载体pBR322
2) 酵母2m质粒
酵母是一种最简单的单细胞真核生物，具有对外源基因翻译后进行蛋 白质加工和修饰的功能。 在啤酒酵母中发现的质粒，多数长度为2m 。在每个细胞中的平均拷 贝数为50-100，能稳定地存活于细胞中。
目前已构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体，也包括穿梭质粒载
(a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子
• 粘性末端DNA片段的连接
具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。但是，在连接反应混合物中， 具有粘性末端的载体DNA分子会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定 的共价闭合的环形结构。这样，就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大 幅上升，最终给重组DNA分子的筛选工作带来麻烦。 用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基团，可以克 服这一缺点。
• 限制性内切酶的命名
命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代 号来命名。如果从同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶，则依次用 罗马数字表示。 举例：EcoRI中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的， R代表大肠杆菌的R株，I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。 从流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株d中分离出来的第三种限制 酶，被命名为HindIII。
的DNA自我/同步复制
(2)具有标记基因
(3) 具有若干限制酶的单一识别位点
(4) 具有较高的外源DNA的载装能力
常见的基因工程载体
包括质粒载体、 噬菌体类载体等。
(1)质粒载体
质粒的一般生物学特性
质粒DNA
质粒DNA的复制类型
质粒载体的构建及重要的质粒载体
(2)DNA连接酶
• DNA连接酶的定义
能将两段DNA拼接起来的酶称为DNA连接酶。该 酶催化DNA相邻的5‘磷酸基团和3’羟基末端之间形成 磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。
OH PBiblioteka 5‘…G-C-T- C-T-G-C-A G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C…5’
弛型）。
2.质粒载体的构建及重要的质粒载体
(1)重组体分子的转化存在三种可能性
(1)没有转化进宿主细胞
(2)质粒发生自身环化，没有重组成功（空载质粒） (3)重组成功（重组质粒）
无抗性 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之外
无抗性
有抗性 有抗性
质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之内
有抗性
无抗性
克隆位点
克隆位点
碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化
• 平末端DNA片段的连接
基因克隆实验中，常用的平末端DNA片段的连接法，主要有同聚物加尾法、接头连 接法等。
(1)同聚物加尾法
同聚物加尾法是利用互补的同聚物序列之间的退火作用完成的连接。其核心部分是， 利用末端脱氧核苷酸转移酶（能够在无模板链的情况下，将核苷酸加到DNA分子单链延 伸末端的3‘-OH基团上）转移核苷酸的特殊功能。
HindIII对双链DNA分子的切割作用
• II型限制性内切酶的主要用途
(1) 在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切割的DNA片段。
对于核苷酸序列已知的DNA分子，可利用此法直接分离目的基因。 (2) 建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱
(a)
B E H BH EH BE
M
3 kb 2kb 1.5 kb 1 kb 500 b
(b)
B B
1.7
3 .3
1.7
E
B
1.6 1.4 0.3
B
E E H H B H B
1.7 0.5 1.2 0.9
E
2.0 3.5 3.5 3.0
B
0.6
B H B B B H
E E
2.3
H
1.5 1.5
E
H
B B
1.0
B
E
H
3.3
限制的遗传信息，贮存在可以 长期保存的稳定的重组体中，以备需要时随时能够应用。这种保存基因组以便重组DNA。
质粒DNA的复制类型
根据寄主细胞所含拷贝数的多少，可将质粒分成两个不同的复制型：
一种是低拷贝数的质粒（1-3份拷贝），称为“严密型”复制控制的质粒；
另一种是高拷贝数的质粒（10-60份拷贝)，称为“松弛型”复制控制的质 粒。
拷贝数的常用定义：生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所
含有的质粒DNA分子的数目。 有的文献定义为每条细菌染色体所平均具有的质粒DNA分子的数目。 一种质粒究竟是属于严密型还是松弛型并非绝对的，还受到寄主的 控制。例如，R1质粒 大肠杆菌寄主（严密型）、奇异变型杆菌寄主（松
OH P DNA连接酶
5‘…G-C-T- C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’ 3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’
DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick)，即双链DNA上的 某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而 不能封闭裂口(gap)，即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形 成的单链断裂。
• 基因工程中常用的DNA聚合酶
耐热DNA聚合酶：是它的发现使PCR扩增特异性DNA片段成为可能。 PCR反应过程中需将模板DNA置于高温下变性、解链，而耐热DNA聚合酶 在靶DNA变性的高温下仍能保持活性，因而在PCR过程中只需一次性加入 反应系统即可，简化了操作过程。 目前有于PCR的耐热DNA聚合酶主要有Taq DNA聚合酶、Pwo DNA 聚合酶和Tth DNA聚合酶等。
(3)重要的质粒载体
为改进转化子筛选技术，有必要用人工的方法构建一种既带有多种抗
药性的选择记号，又具有低分子量、高拷贝、以及外源DNA插入不影响复
制功能的多种限制酶单酶切位点等优点的新的质粒载体。
pBR322质粒载体
酵母2m质粒
pBR322质粒载体
构建pBR322质粒的关键性步骤是，通过体内易位或体外重组加入可
应用互补的同聚物加尾法连接DNA片段
(2)接头连接法
DNA接头，是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特 殊的双链寡核苷酸短片段。
人工接头连接
(3)DNA聚合酶
• DNA聚合酶的定义
具有催化DNA体外合成反应作用的酶称为DNA聚合酶。这类酶的特点在于，能够把 脱氧核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用。 DNA聚合酶作用时大多都需要模板，合成产物的序列与模板互补。
• II型限制性内切酶的识别序列
限制性内切酶在双链DNA上能够识别的核苷酸序列被称为识别序列。 多数限制酶的识别序列由6个核苷酸对组成。 如常用的限制酶EcoRI、HindIII和BamHI的识别序列分别是 GAATTC AAGCTT GGATCC CTTAAG 、 TTCGAA、 CCTAGG。 少数限制酶的识别序列由4个或5个核苷酸对组成，或者由多于6个核苷酸对组成。 如Sau3A的识别序列是GATC MaeIII的识别序列是GTNAC CTAG， CANTG。
天然质粒用作克隆载体的局限性
重要的质粒载体
质粒DNA
质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。
绝大多数是质粒都是由环形双链DNA分子组成的复制子。
环形双链的质粒DNA分具有三种不同 的构型：
共价闭合环形DNA(SC)、开环DNA (OC)和线形DNA(L)。
质粒DNA的分子构型
• 反转录酶：催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应，又称依赖RNA 的DNA聚合酶。 反转录酶是分子生物学中最重要的核酸酶之一。以mRNA模板合成 cDNA，是其最主要的用途。
反转录酶的5‘￫3’方向的DNA聚合酶活性
都齐全了，能够在试管中切割或连接DNA了
4.2 基因工程载体
理想的基因工程载体应具备的特征
限制性内切酶识别序列的共同规律：呈回文结构，即序列被正读和反 读是一样的。 为了便于书写，识别序列可以以5‘￫3’走向的单链DNA表示。例如， 识别序列5‘AAGCTT 3’就可以写成 3‘TTCGAA 5’ AAGCTT。 有的限制酶可识别两种以上的核苷酸序列。例如，AccI既可识别 GTATAC，又可识别GTCGAC。
• 常用的DNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、 T7 DNA聚合酶、耐热DNA聚合酶和反转录 酶等。 到目前为止，已从大肠杆菌中纯化出了三种不同类型的DNA聚合酶，即大肠杆菌 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。 DNA聚合酶I、 DNA聚合酶II的主要功能 是参与DNA的修复过程，而DNA聚合酶III的主要功能与DNA的复制有关。
• DNA连接酶的种类
目前常用的DNA连接酶有大肠杆菌DNA连接酶和T4连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连
接。
T4连接酶可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双 链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间的连接效率比较低。
• DNA连接酶的连接作用
质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 …
4.1 基因工程的工具酶 （1）限制性内切酶
• • • • • 限制性内切酶的定义和分类 II型限制性内切酶的命名 II型限制性内切酶的识别序列 II型限制性内切酶的酶切位点 II型限制性内切酶的的主要用途
• 限制性内切酶的定义
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并在合适的反应条件下使 每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有3‘-OH基团和5’-P基团的 DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。 至今发现的限制性内切酶有三种类型，各具特性，基因工程操作中真 正有用的是II型酶。
• • • • • •
一、基因研究的发展过程 二、DNA的组成、结构和功能 三、基因工程的概念及主要内容 四、工具酶和基因载体 五、基因工程的基本技术 六、基因工程在食品产业中的应用
四、工具酶和基因载体
• 4.1 基因工程的工具酶
限制性内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 …
• 4.2 基因工程载体
无抗性 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之外 质粒的克隆位点 位于抗菌素标记之内
无抗性 有两种抗性 有一种抗性
有两种抗性 有两种抗性
抗菌素抗性基因
抗菌素抗性基因
克隆位点 克隆位点
(2) 天然质粒用作克隆载体的局限性
天然质粒是指那些没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 例如：天然质粒pSC101 特点：只有一个四环素抗性选择标记(Tetr)，三个基因插入失活克隆位点和一个其它 克隆位点(EcoRI)。 缺点：分子量较大(9.1 kb)，拷贝数较低，只有一个抗菌素抗性基因（无法使用插入 失活技术选择重组体分子）
选择的抗药性记号，同时设法除去非必要的区段（亲本质粒DNA上一些对
基因克隆无关紧要的DNA片段，及对DNA克隆无用的限制酶识别位点）， 以降低分子量。
pBR322质粒三个不同来源的组成部分
pBR322质粒的优点 具有较小的分子量(4.36 kb)； 具有两种抗菌素抗性基因 可供作转化子的选择记号； 具有较高的拷贝数
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质 粒DNA具有不同的电泳迁移率。走在最前沿的是 scDNA，其后依次是LDNA和ocDNA。
质粒DNA琼脂糖凝胶电泳模式图
不同质粒DNA分子量差异显著，小的不到1 kb，大的超过500 kb，多 数在10 kb。 标准的质粒命名，通常用一个小写的p来代表质粒，而用一些英文缩 写或数字来对这个质粒进行描述。例如，pBR322，BR代表研究出这个质 粒的研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的头一个字母，322是实验编号。
• II型限制性内切酶的酶切位点
DNA在限制性内切酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开 的位置被称为酶切位点，可用￬表示。 限制酶在DNA上的酶切位点一般是在识别序列内部，如G ￬GATCC、 AT ￬CGAT等。少数在两侧，如￬GATC、 CATG￬等。
DNA分子经限制性内切酶酶切产生的DNA片段末端，因所用限制酶不 同而不同。
质粒载体pBR322
2) 酵母2m质粒
酵母是一种最简单的单细胞真核生物，具有对外源基因翻译后进行蛋 白质加工和修饰的功能。 在啤酒酵母中发现的质粒，多数长度为2m 。在每个细胞中的平均拷 贝数为50-100，能稳定地存活于细胞中。
目前已构建了一系列用于酵母转基因的质粒载体，也包括穿梭质粒载
(a)缺口DNA (b)平末端DNA (c)粘性末端DNA分子
• 粘性末端DNA片段的连接
具粘性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。但是，在连接反应混合物中， 具有粘性末端的载体DNA分子会发生自我环化作用，并在连接酶的作用下重新变成稳定 的共价闭合的环形结构。这样，就会使只含有载体分子的转化子克隆的“本底”比例大 幅上升，最终给重组DNA分子的筛选工作带来麻烦。 用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去其末端的5’磷酸基团，可以克 服这一缺点。
• 限制性内切酶的命名
命名原则一般是以酶源生物的属名和种名前1、2个字母以及株(型)代 号来命名。如果从同一种生物中先后分离到多种限制性内切酶，则依次用 罗马数字表示。 举例：EcoRI中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的， R代表大肠杆菌的R株，I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。 从流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)菌株d中分离出来的第三种限制 酶，被命名为HindIII。