建立犬肺癌模型及制作方法的比较研究

建立犬肺癌模型及制作方法的比较研究
贡桔;张丽云;陈志瑾;夏宁;王忠敏
【摘要】目的比较犬传染性性病肿瘤(CTVT)细胞悬液法及组织块法犬肺移植的成瘤情况.方法选取纯种比格犬20只,分为组织块组及细胞悬液组,每组各10只,于CT引导下分别行CTVT肿瘤细胞悬液及组织块肺内种植.结果细胞悬液组10只犬中7只犬最终肺内成瘤,第10周时16个接种点中最终10个成瘤,成瘤率为
62.50％.组织块组10只犬13个接种点最终全部肺内成瘤,成瘤率为100％.细胞悬液组与组织块组成瘤率的差异有统计学意义(P=0.0205).组织块组实验犬的一般情况较细胞悬液组好,未出现明显恶液质.两组均未发生致死性并发症.结论建立犬肺癌模型时,相比于细胞悬液法,组织块接种法成功率更高,且成瘤犬状态较好.
【期刊名称】《中国介入影像与治疗学》
【年(卷),期】2015(012)009
【总页数】4页(P569-572)
【关键词】动物模型;犬;肺肿瘤
【作者】贡桔;张丽云;陈志瑾;夏宁;王忠敏
【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科,上海200020;上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院放射介入科,上海200020
【正文语种】中文
【中图分类】R814.42;R-332
肺癌是目前最常见的恶性肿瘤之一，由于其早期症状不明显，就诊时大部分患者处于晚期，造成肺癌的病死率较高。

为了解肺癌的生物学特征、制定更有效的治疗方法，需要模拟出与人类肺癌发展过程相似的动物模型。

但适合临床研究的大动物模型始终难以建立，其主要原因之一在于难以找到适合在大动物体内生长的瘤株。

近年来，犬传染性性病肿瘤（canine transmissible venereal tumor，CTVT）因其可靠的稳定性、异种移植性而成为动物模型研究的热点。

本研究通过制作CTVT 肿瘤细胞悬液及组织块，并于CT引导下进行肺内种植建立犬移植性肺癌模型，并对两种方法的成瘤情况进行比较，以期优化该模型的制作方法。

1 材料与方法
1.1 实验动物及分组选取20只纯种比格犬，雌雄不限，体质量9.6～14.2kg，随机分为细胞悬液组及组织块组，每组各10只。

1.2 CTVT细胞悬液及组织块制备取CTVT新鲜瘤株，于比格犬皮下传代，成瘤后取出肿瘤组织。

细胞悬液制备：将肿瘤组织切成细碎组织块，采用细胞过滤筛进行分离，以1500r／min将滤液离心10min，采用Hank＇s液处理沉淀物，采用苔盘蓝法行细胞染色，将活细胞浓度调整至108／ml，待用。

组织块制备：将肿瘤组织切制成约
2.0mm的小组织块，待用。

1.3 方法
1.3.1 接种前准备术前4天起给予接种犬口服环孢霉素l0mg／kg，每天2次。

接种前晚犬禁水禁食。

CT扫描及穿刺引导设备采用Siemens Somatom Definition AS 64排螺旋CT，扫描参数：管电压120kVp，管电流200mA，层厚5mm。

1.3.2 肺内接种于CT引导下行经皮穿刺CTVT细胞悬液及组织块植入。

接种犬腹腔麻醉后仰卧位固定，行胸部CT扫描确定穿刺点、进针途径及预接种部位，根据各犬情况进行左侧、右侧或双侧肺叶植入。

消毒铺巾，细胞悬液组以22GChiba
针自穿刺点进针到达靶部位，重复扫描确定针尖位于适当位置后，注入1.0ml肿
瘤细胞悬液，拔针后重复扫描观察肺内有无气胸、出血等情况。

组织块组以16G
导引针穿刺至靶部位，重复扫描确定针尖位于适当位置后，取2～3枚肿瘤组织块及2块无菌明胶海绵条放入穿刺针内，推入肺内后拔针，重复扫描观察肺内有无
气胸、出血等情况。

1.3.3 观察方法接种后犬饲养于温控房间内，予正常饮食饮水。

每天记录实验犬的一般情况，包括精神、呼吸及进食情况，注意有无发生呼吸衰竭。

于接种后第2、4、6、8、10周对实验犬行胸腹部CT平扫，观察有无肿瘤生长、成瘤大小形态及转移情况。

接种犬自然死亡或于第10周后处死行病理学检查。

1.4 统计学分析采用SPSS 11.0统计软件，计数资料比较采用Fisher确切概率法
检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 成瘤率及肿瘤生长、种植情况细胞悬液组：观察至第10周，10只犬中7只
肺内成瘤，16个接种点共10个点成瘤，成瘤率为62.50%（10／16），最大成
瘤直径3.2cm。

肺内成瘤大小差异较大，多呈类圆形，部分呈多发成瘤（4／10，40.00%，图1）；3只犬发生胸壁种植。

7只出现纵隔淋巴结肿大。

成瘤犬后期均出现少至大量胸腔积液。

1只犬于第9周发现肝脏转移，2只出现对侧肺内转移。

组织块组：观察至第10周，10只犬13个接种点全部肺内成瘤，成瘤率为100%。

肺内成瘤多呈类圆形，边界较清楚（图2）。

最大成瘤直径3.7cm，1例成瘤周围见子灶，2只犬发现胸壁种植。

至第10周，所有成瘤犬未出现纵膈淋巴结肿大，
仅2只犬出现少量胸腔积液。

所有犬未发现有肝脏转移灶，未发现对侧肺内转移。

细胞悬液组与组织块组成瘤率的差异有统计学意义（P＝0.0205）。

2.2 接种并发症及处理情况细胞悬液组接种过程中2例出现少量气胸，2例少量肺内出血。

组织块组穿刺过程中仅出现2例少量气胸，上述犬均无气急、气促、呼
吸困难等症状，未做特别处理，继续观察、均于1周内自愈。

两组均未发生大量
出血、气胸等致死性并发症。

图1 细胞悬液组植入后成瘤，右肺野见大小不等多发结节图2 组织块组右侧肺叶植入后单个成瘤（箭）图3 组织块组成瘤大体观肿瘤边界清，质韧，膨胀性生长（箭）
2.3 一般情况组织块组实验犬精神、饮食、呼吸等无明显变化，观察至第10周，未出现明显恶液质及自然死亡。

细胞悬液组自第8周以后实验犬逐渐出现精神差、呼吸急促，随着胸腔积液的增多，呼吸急促现象更加明显。

至第9、10周以后成
瘤犬出现明显恶液质状态，其中1只犬死于呼吸衰竭。

2.4 病理学检查移植后CTVT成瘤大体呈膨胀性生长，质韧，肿瘤中心未见明显坏死，邻近支气管无明显侵犯（图3）。

组织学上，大片多形性肿瘤细胞构成CTVT 瘤巢，细胞核浓染，内可见粗大成群的染色质，核仁明显增大。

3 讨论
由于肺癌确诊时多数患者已属于中晚期，或因患者年老体弱，重要脏器功能不佳等原因失去手术切除机会。

如何使患者得到有效合理的治疗，延长生存期、改善生存质量是当前肺癌治疗研究的重点，介入治疗（如血管内化疗、射频消融、放射性粒子植入等）被越来越广泛地应用于中晚期肺癌患者的治疗中［1］，但相关的动物实验研究进展相对缓慢，其主要原因在于缺乏适合微创介入诊疗研究的大动物模型。

为了解肺癌的生物学特征及制定更有效的肺癌诊断、治疗方法，需要模拟出与人类肺癌病因、发病机制、发展过程相似的动物模型。

动物模型的制作方法主要包括自发性、诱发性、移植性及转基因等，其中最常用的为移植性模型。

移植性动物模型
又分为异位移植和原位移植。

异位移植中应用较多的是将瘤细胞接种于动物皮下（腋部、背部、后肢等），此种方法虽然简便易行、成瘤率高，且易于跟踪观察肿瘤生长情况，但皮下移植的肿瘤脱离了起源组织器官的微环境。

一些肿瘤的转移表型需在原位种植后才能表达，因此异位移植模型得到的实验结果常与临床应用的实际效果存在较大差异。

此外，异位移植模型较少在种植部位以外发生转移灶，与人类肺癌发生发展的自然病程不一致。

原位移植肺癌动物模型是将肿瘤细胞或组织块原位移植至动物呼吸系统的组织内，使之产生肿瘤及形成自发性转移灶。

原位移植模型能够模拟肺癌的病理生理环境，对于肺癌实验研究具有重要的意义。

因此，原位移植模型是目前较为理想的动物模型。

目前国内外移植性肺癌模型大多采用鼠和兔［2－9］，但鼠的接种器官体积较小，组织较脆弱，原位注射肿瘤细胞操作难度大，且原位移植时需要麻醉和手术，由于裸鼠免疫系统缺陷、耐受力差，使移植后病死率较高，降低了模型建立的成功率。

兔拥有自身VX2肿瘤细胞株，对兔无免疫原性，因而VX2肿瘤细胞株被广泛应用于兔的肝脏、肺部、皮肤等部位制作肿瘤模型。

但兔的体积较小，肺部移植成瘤体积也较小，不适用于介入治疗等的实验研究。

相比之下，犬在解剖、生理及对疾病的反应上与人类相似，且犬的体积大小适宜、饲养管理方便，是比较理想的肺癌模型制作对象。

由于犬的支气管动脉与人类接近，可进行DSA造影及用于介入治疗后的临床研究。

但目前采用犬制作肺癌移植性模型的报道罕见，其主要原因之一在于难以找到适合的瘤株。

CTVT是一种以性接触传播为主的犬类动物生殖系统肿瘤，该肿瘤细胞具有特殊的生物活性：在宿主体内能够通过主要组织相容性复合体屏障，逃避机体免疫监视从而增殖成瘤［10］，为大动物肺癌模型的建立提供了理想的
细胞株。

本研究采用CTVT肿瘤细胞悬液及组织块进行犬肺内移植，两组植入后均未出现大量气胸、出血等致死性并发症，表明两种植入方法均具有较好的安全性。

结果显示
细胞悬液组成瘤率为62.50%（10／15）明显低于组织块组100%（13／13）。

但细胞悬液组的胸腔积液、胸壁种植及纵隔淋巴结转移的发生率明显高于组织块组。

可能由于组织块法植入时游离细胞较少，且在植入过程中有明胶海绵保护，减少了肿瘤细胞反流，从而降低了胸腔、胸壁种植的发生率。

后期细胞悬液组实验犬随着胸腔积液增多、恶液质等原因一般情况迅速恶化，甚至出现呼吸衰竭。

而组织块组实验犬一般情况较好，观察期间未出现明显的恶液质及自然死亡，更有利于进行后续介入治疗等实验研究。

此外，多发肺肿瘤动物模型不适于研究和评估治疗方法，因此，建立孤立局限的肺内肿瘤模型对于肺癌的研究至关重要。

细胞悬液组部分成瘤周围出现子灶（4／10，40.00%），而组织块组则大多为单个成瘤，更有利于
后续治疗的评估。

孙志超等［11］采用CT引导下经皮CTVT细胞悬液注射法建立原位移植性犬肺癌模型，接种点成瘤率为66.7%，平均成瘤直径约为2cm，该模型的胸壁种植及胸
腔积液、淋巴结转移率较高。

之后孙志超等［12］又采用CTVT组织块植入法，6只犬12个接种点全部成瘤，肿瘤最大径为（2.73±0.14）cm，且减少了针道与胸壁种植的发生率，肿瘤形态趋于不规则。

有研究［13］认为不规则的肿瘤形态对
于后续射频消融等治疗具有更大的研究意义。

总之，动物模型是进行试验研究的重要手段和平台，对肺癌的发生机制、诊断及治疗的研究具有十分重要的意义。

本研究结果显示，组织块接种方式相比于细胞悬液注射法成功率更高，成瘤犬发生转移及胸腔积液较少见，且成瘤犬一般情况好，是适合微创介入治疗研究的理想大动物模型。

［参考文献］
［1］张华玲，刘斯润，童涛，等.CT评价单纯氩氦刀冷冻术联合放疗粒子治疗非小细胞肺癌的疗效.中国介入影像与治疗学，2012，9（7）：503-507.
［2］张重辉，张冬红，王强，等.肺癌兔模型的建立及经皮肺穿刺后癌细胞转移
的研究.河北医药，2013，35（16）：2452-2453.
［3］王力伟，张丽云，王忠敏.移植性肺癌动物模型研究进展.介入放射学杂志，2015，24（6）：569-573.
［4］石宝琪，刘照信，祁辅亮，等.兔VX2肺癌模型的建立及 MR观察.包头医学院学报，2013，29（2）：7-9.
［5］胥孜杭，刘菲，邹纯朴，等.小鼠肺癌原位模型的建立.中国医药导报，2015，12（1）：15-18，169.
［6］陈为，于淼，房星宇.CT引导125I粒子植入术治疗非小细胞肺癌.中国介入
影像与治疗学，2012，9（5）：319-321.
［7］孙高峰，彭婕，彭烨，等.CT引导下双针共轴穿刺法建立兔肺孤立VX2移
植瘤模型的实验研究.介入放射学杂志，2013，22（5）：399-402.
［8］石宝琪，张强，刘兆信，等.兔VX2肺癌模型的建立及 MSCT观察.内蒙古
医学杂志，2010，42（12）：1416-1418.
［9］张东升，王运仓，王强，等.兔 VX2肺癌模型的建立及鉴定.河北医药，2014，36（2）：171-173.
［10］ Higgins DA.Observations on the canine transmissible venereal tumour as seen in the Bahamas.Vet Rec，1966，79（3）：67-71.
［11］孙志超，董伟华，肖湘生，等.犬传染性性病肿瘤肺癌模型的建立和生物学特性的观察.介入放射学杂志，2010，19（12）：972-976.
［12］孙志超，董伟华，肖湘生，等.犬肺肿瘤模型的制作及优化.中华放射学杂志，2014，48（3）：241-242.
［13］ Ahmed M，Liu Z，Afzal KS，et al.Radiofrequency ablation：Effect
of surrounding tissue composition on coagulation necrosis in a canine
tumor model.Radiology，2004，230（3）：761-767.。