试剂盒组成（50T）

试剂盒组成（50T）
实验⼀:遗传分⼦标记系列实验
⼀、实验⽬的:通过不同个体基因组遗传分⼦标记的检测了解遗传标记多态性的应⽤意义，掌握检测技术⽅法。

⼆、实验原理：
在整个⼈类基因组中⼤约有5-10万个微卫星DNA的重复单位，微卫星DNA指DNA基因组中⼩于10个核苷酸的简单重复序列，⼴泛存在于真核基因组中，多数以2-6个碱基为核⼼单位、重复10-60次、长度50-150bp的串联重复排列的序列。

由于微卫星DNA在基因组中分布⼴、数⽬多，在⼈群中表现出多态现象，且符合孟德尔遗传规律，因⽽为连锁分析提供了⼤量遗传标记，微卫星DNA因基因重复单位很短，所以⼜称短串联重复序列（short tandem repeats, STR）、简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）。

微卫星DNA由于基因重复单位⼩，重复次数有较⼤变化，所以⼜称为可变的串联重复单位。

不同⼈体基因组卫星DNA重复单位的数⽬是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因⽚段长度多态性。

根据这⼀规律，应⽤STR基因分型技术就可将不同个体进⾏区别，并可进⾏个体间的遗传学分析，从⽽进⾏个体识别和亲权鉴定。

近年来，这⼀技术也⼴泛应⽤于考古学、遗传学以及肿瘤学等领域。

三、实验器材与试剂
PCR仪，恒温⽔浴箱，电泳仪，⽔平电泳槽，垂直电泳槽，离⼼机，移液器，旋涡振荡器，SE全⾎DNA⼩量提取试剂
盒，TakaRa Taq TM PCR试剂盒，聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染试剂。

四、实验步骤
（⼀）⼈基因组DNA的提取
⽤TakaRa公司⽣产的Blood Genome DNA Extraction Kit从⼈全⾎中提取淋巴细胞的基因组DNA。

操作步骤：
1. 按处理样品数准备1.5 ml离⼼管，并各加⼊GenTLE Solution I 500 µl。

2．把混合均匀的100 µl⾎液，加⼊到分装好的GenTLE Solution I的离⼼管中，⽴即振荡数秒钟*1。

*1 不管处理多少样品，⾎液加⼊到GenTLE
Solution I中，要⽴即进⾏振荡混合，否
则有可能降低收量。

3．室温放置10分钟以上，然后在室温*2条件下12,000 rpm以上离⼼5分钟。

离⼼时，请注意离⼼管在离⼼机⾥的摆放⽅向要统⼀，离⼼管的⼩⽿朵朝上（见下图A）。

此时⼏乎看不到DNA沉淀。

*2 若离⼼温度低，会对收量和纯度有影响，
请于20℃以上离⼼。

4. ⽤移液枪⼩⼼除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离⼼管外侧（带⼩⽿朵⼀侧）的内壁上，除
去溶液时，请⼀定注意枪头不要碰到离⼼管外侧的内壁，插到离⼼管内侧的底部（见下图B），注意不要吸⾛沉淀物。

5. 加⼊1 ml的GenTLE Solution II。

此时GenTLE Solution II应沿着离⼼管内侧的内壁加⼊到离⼼管中
（见下图C）。

6. 轻柔地上下颠倒离⼼管数次*3，室温12,000 rpm以上离⼼2分钟，⽤移液枪⼩⼼地除去上清溶液
（⽅法参见实验操作4.）。

*3 剧烈振荡将影响收量和纯度。

7. 向离⼼管中加⼊GenTLE Solution III 500 µl，轻微振荡10秒钟充分混合。

8. 室温12,000 rpm以上离⼼5分钟，把上清溶液移⾄另⼀个新的离⼼管中。

9. 加⼊等体积（500 µl）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合。

10. 4℃、12,000 rpm离⼼5分钟，⼩⼼除去上清溶液*4。

*4 GenTLE Solution III中含有影响酶反应的物质，所以⼀定要除净上清溶液，但应注意不要吸⾛沉淀。

11. 加⼊1 ml的70%⼄醇清洗沉淀，4℃、12,000 rpm离⼼5分钟，⼩⼼地除去上清溶液（⽅法参见*4）。

12. ⼲燥沉淀*5。

*5 因为该⽅法提取的DNA较⼤，完整性好，所以请⼀定不要⼲燥过度。

Tube中看不到有明显的液体或没有⼄醇⽓味后，就可以加⼊TE进⾏溶解。

如果沉淀已经变⽩，说明⼲燥过度，此时加⼊
TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能会受到影响。

13. 根据下⼀步实验需要，⽤10～50 µl适当的缓冲液（例如TE缓冲液等）溶解沉淀。

图
特别注意
操作步骤4（除去GenTLE Solution I和⾎液混合物）以及操作步骤9（除去GenTLE Solution III
和异丙醇混合物）的实验操作特别重要，请严格按操作⽅法进⾏。

（⼆）PCR反应扩增遗传分⼦标记
以不同位点引物扩增不同个体遗传分⼦⽚断扩增
A1：Primer F:5'-ATGAAATCAACAGAGGCTTG
Primer R:5'-ACTGCAGTCCAATCTGGGT
A2：Primer F:5'-TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCG
Primer R:5'-CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTCA
反应体系如下:
基因组DNA 0.5
引物A1或A2 1
10Buffer 2.5
dNTP 0.5
Taq 0.25
ddH2O 20.25
25µl
混匀
离⼼⼏秒
⽤eppendorf PCR仪扩增,PCR反应条件如下:
94℃3’ 94℃30s 49.5或47.9℃30s 72℃30s 72℃3’
35cycle
（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染⽅法
⼀、电泳试剂：
1、30%聚丙烯酰胺（29：1）
丙烯酰胺29克，Bis 1克，ddH2O 100ml。

2、10%过硫酸胺（现配现⽤）
过硫酸胺0.1克，ddH2O 1ml
3、TEMED
4、5×TBE
Tris 27克, 硼酸13.75克，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，定容⾄500ml。

⼆、银染试剂
1、固定液：100ml⽆⽔⼄醇，5ml冰醋酸，定容⾄1000ml。

2、0.2% AgNO3: AgNO3 1克，ddH2O 500ml。

3、1.5% NaOH: NaOH 7.5克，ddH2O 500ml。

4、37%甲醛。

三、配胶（6%）：
12ml
ddH2O 7.1ml
5×TBE 2.4ml
30%聚丙烯酰胺 2.4ml
10%过硫酸胺84µl×2
TEMED 8.4µl×2
室温凝固时间>6⼩时。

四、上样：每班将5个样本的A1和A2位点的PCR扩增产物上样。

五、电泳：电泳缓冲液为0.5×TBE
六、银染：
1、固定液固定10min。

2、⽔洗2min×3次。

3、0.2% AgNO3 100ml+37%甲醛50µl，混匀，避光染⾊30～50min。

4、⽔洗20秒×2次。

5、1.5% NaOH 100ml，加37%甲醛0.5ml，混匀，显⾊3～10min。

6、⽔洗若⼲次，终⽌显⾊。

7、⽤数码相机拍摄电泳图⽚，分析不同个体的A1和A2位点。

注意事项：
电泳时间：150V×1.5h，溴酚兰的位置相当于40bp。

银染后胶⾯积将膨胀10%。

在终⽌显⾊过程中，将依惯性继续显⾊，所以不等显⾊到位即可进⾏终⽌显⾊。

显⾊到位后⽴即拍摄，⽔浸泡过夜将使背景加深。

实验⼆、Northern杂交系列实验
⼀、⽬的要求：通过Northern杂交系列实验，学习和掌握分⼦⽣物学研究中常⽤的实验⼿段，为今后的分⼦操作打下技术基础。

⼆、实验原理：
继分析DNA的Southern杂交⽅法出现后，1977年Alwine等⼈提出⼀种与此相类似的、⽤于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分⼦⼤⼩和丰度的分⼦杂交技术，这就是与Southern相对应⽽定名的Northern杂交技术。

这⼀技术⾃出现以来，已得到⼴泛应⽤，成为分析mRNA最为常⽤的经典⽅法。

与Southern杂交相似，Northern杂交也采⽤琼脂糖凝胶电泳，将分⼦量⼤⼩不同的RNA 分离开来，随后将其原位转移⾄固相⽀持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再⽤放射性（或⾮放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进⾏杂交，最后进⾏放射⾃显影（或化学显影），以⽬标RNA所在位臵表⽰其分⼦量的⼤⼩，⽽其显影强度则可提⽰⽬标RNA在所测样品中的相对含量（即⽬标RNA的丰度）。

但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进⾏酶切，即是以各个RNA分⼦的形式存在，可直接应⽤于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA⽔解，因此不进⾏碱变性，⽽是采⽤甲醛等进⾏变性电泳。

虽然Northern也可检测⽬标mRNA分⼦的⼤⼩，但更多的是⽤于检测⽬的基因在组织细胞中有⽆表达及表达的⽔平如何。

本实验拟研究⼩⿏CRBN基因mRNA在肝、肺、⼼脏、脑、肾等组织的表达情况。

三、实验器材与试剂
杂交炉，PCR仪，恒温⽔浴箱，电泳仪，⽔平电泳槽，离⼼机，移液器，旋涡振荡器，压⽚暗盒，柯达X光胶⽚，Reverse Transcriptase M-MLV，TakaRa Taq TM PCR试剂盒，3S PCR Product Purification Kit V3.1，DIG DNA 标记试剂盒Ⅰ，地⾼⾟杂交检测试剂盒Ⅱ。

四、实验步骤
（⼀）总RNA的抽提(戴⼿袋操作)
（1）取⼩⿏肝、肺、⼼脏、脑、肾组织。

（2）取黄⾖⼤组织加1mL TRIzol试剂，⽤超声打碎组织。

(3) 每使⽤1mL TRIzol加⼊0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放臵3分钟。

(4) 2-8℃12000×g离⼼15分钟。

样品分为三层：底层为黄⾊有机相，上层为⽆⾊⽔相
和⼀个中间层。

RNA主要在⽔相中，⽔相体积约为所⽤TRIzol试剂的60℅。

(5) 把⽔相转移到新管中（如要分离DNA和蛋⽩质可保留有机相），⽤异丙醇沉淀⽔
相中的RNA。

每使⽤1mL TRIzol加⼊0.5mL异丙醇，室温放臵10分钟。

(6) 2-8℃12000×g离⼼10分钟，离⼼前看不出RNA沉淀，离⼼后在管侧和管底出现胶
状沉淀。

移去上清。

(7) ⽤75℅⼄醇洗涤RNA沉淀。

每使⽤1mL TRIzol⾄少加1mL75℅⼄醇。

2-8℃不超
过7500×g离⼼5分钟，弃上清。

(8) 室温放臵⼲燥或真空抽⼲RNA沉淀，不要晾得过⼲，否则不易溶解。

加⼊25-200µL
⽆RNase的⽔或0.5℅SDS，⽤枪头吸打⼏次，55-60℃放臵10分钟使RNA溶解，如RNA⽤于酶切反应,勿使⽤SDS溶液。

RNA也可⽤100℅的去离⼦甲酰胺溶解，-70℃保存。

（9）紫外分光光度计检测总RNA浓度。

(10) 1%琼脂糖凝胶⽔平电泳检测抽提的总RNA质量。

附：RNA质量检测
提取的RNA需要对其质量和数量进⾏检测。

实验室常⽤的⽅法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。

紫外吸收检测
试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。

dH2O
试验程序
1．预热紫外分光光度计10～20min.。

2．取两个2ml的狭缝⽯英杯，⼀个装⼊2mlTE溶液作为空⽩校正液，⽤来校正分光度计零点及调整透光度⾄100。

3．取8µl RNA待测样品加⼊另⼀⽐⾊杯中，加ddH2O⾄2ml，⽤⽆菌⽯蜡膜堵住杯⼝，倒转混匀。

4．将两个⽐⾊杯臵于分光光度计中，调⼊射光波长，⽤空⽩溶液分别调整T⾄100、OD ⾄0，然后测定样品在260nm、
280nm、230nm的OD值。

RNA浓度和纯度分析
浓度计算：对于单链RNA，OD260＝1.0时，RNA浓度为40µg/ml，按照上述稀释⽅式，即OD260＝0.1时，其RNA浓度为
1µg/ml。

纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的⽐值应介于1.7~2.0，⼩于此⽐值说明有蛋⽩或苯酚污染，如果⽐值⼤于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230⽐值应⼤于2.0，如果⼩于此⽐值说明有⼩分⼦及盐类污染。

（⼆）逆转录（RT）
逆转录⽤TaKaRa公司⽣产的Reverse Transcriptase M-MLV逆转录酶，该酶是通过基因重组技术克隆表达的RNase H活性缺失型M-MLV反转录酶。

⼀般的野⽣型M-MLV （Moloney Murine Leukemia Virus）具有以下⼏种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。

由于RNase H能够催化降解DNA/RNA 杂合体中的RNA，因此在cDNA第⼀条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。

该酶M-MLV（RNase H¯）的RNase H活性缺失，延伸能⼒强，可⽤于较长的cDNA合成以及⾼⽐例的全长cDNA⽂库的构建等。

逆转录操作步骤：（戴⼿袋操作)
●1st-Strand cDNA合成的实验操作⽅法
1. Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6 µl。

* Total RNA的使⽤量⼀般为1 ng～1 µg；mRNA的使⽤量⼀般为10 pg～1 µg。

2. 70℃保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。

3. 离⼼数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。

4. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。

* 当起始模板RNA量＞500 ng时，RTase M-MLV（RNase H¯）的使⽤量应＞0.25 µl。

5. 42℃保温1⼩时*。

* 以Random Primers作为反转录引物时应先进⾏30℃，10分钟反应，然后再在42℃条件保温1⼩时。

6. 70℃保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接⽤于2nd-Strand cDNA的合成或者
PCR扩增等，PCR扩增时cDNA溶液的使⽤量建议使⽤1 µl～5 µl。

（三）CRBN探针标记
1、DIG 标记CRBN探针
应⽤地⾼⾟DNA标记试剂盒进⾏CRBN探针的DIG 标记
地⾼⾟DNA标记试剂盒是通过PCR反应将地⾼⾟-dUTP 掺⼊DNA探针的快速标记⽅法。

地⾼⾟标记的探针⾼度稳定，⽤途⼴泛，可⽤于：⾮同位素的Southern Blot、Northern Blot、菌落杂交和斑点印迹杂交分析等。

地⾼⾟DNA标记试剂操作⽅法
合成CRBN引物：
Primer F: TAGTGAAAGTGAAAGCAATTG
Primer R: TAAGGAGCTGAA TTCTCAATA
（1）. 制备反应液:
正向引物(50–100 pmol) X µl
反向引物(50–100 pmol) X µl
cDNA 模板(10–20 ng/µl) 1 µl
10X PCR 缓冲液2 µl MgCl
2 2 µl
Dig-dUTP 标记混合物 1 µl
H
2
O* X µl
Taq DNA聚合酶0.5 µl
----------------------------------------
总体积20 µl
*⽤蒸馏⽔补⾜20 µl总反应体积
注意：如使⽤试剂盒中的对照引物组合，则⽤1µl对照引物组合替换正向引物和逆向引物。

（2）. PCR扩增程序：30个循环
94℃30秒
56℃1分钟
72℃2分钟
末次循环后样品臵于–20℃。

（3）.检测扩增产物：制备1.0%的琼脂糖凝胶，取1µl PCR产物稀释5倍后电泳检测。

（4）．检测扩增产物的地⾼⾟掺⼊：取
1 µl 扩增产物，倍⽐稀释点样于尼龙膜上，根据⾃⼰偏好的⽅法进⾏检测，如化学发光或化学显⾊。

2、⽤3S PCR Product Purification Kit V3.1试剂盒纯化CRBN探针
试剂盒组成：
注：
(a)⽤前须在Wash Solution瓶中加⼊50ml⽆⽔⼄醇，充分混匀后使⽤。

每次使⽤后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的⼄醇含量。

(b)TE pH8.0或者⽔均可以⽤于洗脱，但是⽔洗脱效率通常要低⼀些。

测序样品请⽤⽔洗脱。

(c) 该试剂盒不能⽤于从Agarose胶中回收DNA⽚段。

试剂盒DNA回收率：
3S 柱对100bp以上的DNA⽚段有较好的结合性能和回收率，回收率在60%以上。

主要⽤途：
1.去除PCR反应中 dNTPs，引物，矿物油和聚合酶等。

2.从反应体系中去除限制性内切酶或修饰酶，回收和浓缩DNA。

操作步骤：从PCR反应体系中回收PCR扩增产物：
1. PCR结束后，从PCR反应管中将反应液移⾄⼲净的1.5 ml Eppendorf离⼼管中，加⼊4倍体积的Solution BS混匀。

⽆论样品量多少，最少需要使⽤400ul Solution BS。

2. 将3S柱放⼊收集管中，把混合液转移到柱内，不要盖上离⼼管盖，室温放臵2分钟；盖上离⼼管盖(盖⼦也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担⼼混淆或弄翻溶液，建议您盖上离⼼管盖⼦)，⽤台式离⼼机⾼速离⼼（10000 rpm）1分钟。

3.倒掉收集管中的废液，将3S柱放⼊同⼀个收集管中，加⼊600µl Wash Solution，⾼速离⼼（10000 rpm）1分钟。

4.重复步骤3⼀次。

5.倒掉收集管中的废液，将3S柱放⼊同⼀个收集管中，⾼速离⼼（10,000 rpm）２分钟。

6.将3S柱放⼊⼀根新的1.5ml离⼼管中，在3S柱膜中央加30µl TE或⽔，不要盖上离⼼管盖，室温或37℃放臵2分钟。

◆提⾼洗脱温度有利于提⾼DNA 的洗脱效率。

7.盖上离⼼管盖，10,000rpm⾼速离⼼1分钟，离⼼管中的液体即为回收的DNA⽚段，可⽴即使⽤或保存于-20℃备⽤。

8．1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物纯化效果。

（四）Northern杂交
概述Northern杂交可以选⽤DIG或者BIOTIN标记的RNA探针或DNA探针，但RNA探针显⽰更强的杂交信号和更低的⾮特异性背景，因此只要可能，可尽量选⽤RNA探针。

但由于RNA探针在操作中的严格性⽐使⽤DNA探针更⾼。

因此⼤多数研究者仍使⽤DNA探针，在此情况下，建议使⽤Hyb⾼效杂交液以减少背景。

探针的浓度因⽬的基因的丰度和所采⽤的检测⽅法不同⽽有所差异。

如采⽤化学显⾊法时，探针浓度建议为30－80ng/ml，采⽤CSPD化学发光检测时，探针浓度建议为20－
50ng/ml，如果采⽤CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很⾼，因此，还要适当降低探针浓度(约10－25ng/ml)。

1、变性琼脂糖凝胶电泳
试剂及其配制
1. 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2O⾄80ml, 调pH⾄8.0, 定容⾄100ml。

2．50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2O⾄500ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37℃过夜，⾼压灭菌。

3．5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS [3-(N-玛琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, ⽤2N NaOH调pH⾄7.0, 再加⼊0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2O⾄500ml。

⽆菌抽滤，室温避光保存。

4．20×SSC: NaCl 175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O⾄800ml，⽤2N NaOH调pH⾄7.0，再⽤ddH2O定容⾄1000ml。

DEPC处理、⾼压灭菌。

5. 2×SSC: 20×SSC 100ml加ddH2O⾄1000ml。

DEPC处理,⾼压灭菌。

变性琼脂糖凝胶电泳操作步骤：
将制胶⽤具及电泳槽⽤0.5mol/L的NaOH浸泡半⼩时以上，⽤DEPC处理⽔冲洗⼲净，晾⼲备⽤。

1. 变性胶的制备：取琼脂糖0.4g，加⼊DEPC H2O 24.8ml，加热熔化，于保温状态下加⼊5×甲醛凝胶电泳缓冲液8.0ml、37%甲醛7.2ml，混匀、制胶。

待胶凝固后，臵1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。

2. 样品制备：取总RNA4.5µl(约20-30µg) ，加⼊5×甲醛凝胶电泳缓冲液4.0µl、37%甲醛
3.6µl、甲酰胺10µl，65℃温育15min、冰浴5min。

加⼊EB（1µg/µl）1µl、上样缓冲液2µl。

3. 电泳：上样，80V电泳（电泳时间约1.5hr左右）。

电泳结束后将胶块臵紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位臵（离加样孔的距离）。

附：RNA样品质量分析：
完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。

其中28S rRNA 条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品⽐较完整，基本⽆降解。

如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发⽣降解。

如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。

2. 转膜和RNA的固定
转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳采⽤变性电泳⽅法，根据需要选⽤适当的分⼦量标准。

1. 在完成电泳后，凝胶⽤DEPC-H2O淋洗除去甲醛，然后臵于2×SSC中浸泡15～30分钟。

2. 搭建转膜平台：在⼤⼝盘中放⼊⽀持物如玻璃板，玻璃板应⽐⽀持物长。

剪⼀块滤纸，横放在玻璃板上，滤纸两端浸⼊盘
中，⽤20×SSC浸湿，并向盘中加⼊⾜量的20×SSC。

3. ⽤⼑将部分凝胶切去，并左下⾓切去⼀⼩块作为凝胶⽅位的记号。

将凝胶臵于平台中央，除去⽓泡。

4. 剪⼀张尼龙膜，⼤⼩与凝胶相当，在⽆RNase的⽔中浸泡5分钟，然后将其臵于凝胶表⾯。

膜臵于凝胶表⾯后不易挪动，膜与凝胶之间不应留有⽓泡。

5. 取两张与尼龙膜同样⼤⼩的滤纸，⽤20×SSC浸湿后臵于膜上，⽤玻棒赶⾛⽓泡。

将⼀叠略⼩于滤纸的吸⽔纸臵于滤纸上，在纸上平放⼀玻璃板，然后在玻璃板上压⼀重物，室温下转膜4～6⼩时或过夜。

注：可以使⽤其它的转膜仪器进⾏以上过程，请遵循制造商的操作⼿册。

6. 转膜完成后，将膜臵于⼀张⼲的滤纸上，⽤铅笔在膜上标记加样孔位臵，⽤2×SSC洗膜，再臵于⼲滤纸上使膜晾⼲。

7. RNA的固定：
A）UV交联：；将膜⽤UV照射交联。

总照射剂量依膜的不同⽣产商⽽异，请按照膜的使⽤说明书和UV CROSSLIKER的操作⼿册进⾏。

B）真空烘烤固定：将膜夹在两张滤纸之间，80℃真空烘烤2⼩时。

3. 杂交
A. 预杂交:
1. 将膜从包装袋中取出，⽤⼲净的剪⼑将膜溴酚蓝以下的部分剪去。

放⼊杂交袋中，在封
⼝机上将杂交袋三⾯封⼝。

2. 加⼊65℃预热的Hyb⾼效杂交液5mL，排尽⽓泡，封⼝。

放65℃⽔浴振荡杂交1～2⼩
时。

3. 如果使⽤杂交管杂交，则根据杂交管体积，加⼊适量的杂交液(5-10ml)。

如果膜的⼤⼩
适中，也可以⽤⽆菌的50ml离⼼管(BD公司)进⾏，5ml杂交液已⾜够。

将杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟预杂交1～2⼩时。

*如使⽤杂交管,将尼龙膜有颜⾊的⼀⾯向⾥
B. 杂交:
1. 探针的处理：将标记的探针放100℃煮10分钟，⽴即放冰浴冷却10分钟。

2. 将杂交袋从⽔浴中取出，剪去⼀⾓并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5mL Hyb⾼效杂交液，加⼊处理过的探针(1-3µl/膜，10－25ng/ml Hyb⾼效杂交液)，混匀。

加⼊到杂交袋中，⼩⼼排尽⽓泡，封⼝，65℃⽔浴振荡杂交过夜。

3. 如果使⽤杂交管杂交，则倒出预杂交液，另取适量的Hyb⾼效杂交液(5-10ml)，加⼊变
性过的探针(1-3µl/膜，或10－25ng/ml Hyb⾼效杂交液)，混匀。

加⼊到杂交管中，杂交仪设定为65℃，8-15转/分钟，杂交过夜。

C. 洗膜：
1. 剪开杂交袋，⽤镊⼦取出膜，放⼊装有20mL的2×SSC 0.1% SDS溶液的平⽫中，在
室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。

2. ⽤镊⼦将膜转⼊0.1×SSC 0.1% SDS溶液(先放50℃⽔浴预热)中，50℃⽔浴振荡洗
涤两次，每次15分钟。

3. ⽤镊⼦将膜取出转⼊装有20mL洗涤缓冲液的平⽫中振荡洗涤5分钟。

4. 检测杂交信号：化学发光法
⽤地⾼⾟杂交检测试剂盒II
试剂盒组成:
阻断液母液(10×) 50 ml
抗DIG-AP 酶结合物10 µl
CDP-Star发光底物100 µl
检测缓冲液(5×) 50 ml
顺丁烯⼆酸缓冲液母液(2x) 500 ml
Tween-20 3 ml
10% SDS 20 ml
20×SSC 100 ml
* 使⽤前先⽤DEPC/⽆RNase⽔将5×检测缓冲液及2×顺丁烯⼆酸缓冲液母液稀释成1×⼯作液。

１．所需试剂：
请按下表组分准备所需试剂。

２．制备试剂盒⼯作液
３．流程：在100cm2的上进⾏信号检测。

注意: 所有孵育过程应在15-25°C下搅动进⾏，如果膜要⽤于再杂交，则不要让膜在任何时候变⼲。