siRNA设计原则
RNAi片段siRNA设计原则RNAi目标序列的选取原则应遵循以下几个
RNAi片段siRNA设计原则RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。
Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA 结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。
以下为一些文献中提出的原则补充，很不错。
General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and thetermination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects onother genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNAsequence. The control RNA should have the same length andnucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 basesmismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create new homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitablesequence is found, then,References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNAs. Methods.26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS,Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. NatBiotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA DesignRNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted geneshould be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), orNAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in thecytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs havesuccessfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology withother related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at/LocusLink/. Once the locus of yourgene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequence(RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at/entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)"and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query toolat /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mRNA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimizeoff-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search.∙NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches∙Blat tool on UCSC Genome Website/cgi-bin/hgBlat∙Ensembl Blast /Multi/blastview Examples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001 Jan15;15(2):188-200.。
sirna设计方法
sirna设计方法siRNA设计方法是一种用于靶向基因沉默的有效工具，其通过干扰RNA干扰的方式来沉默特定基因。
siRNA设计的关键是选择合适的siRNA序列，使其能够特异性地靶向目标基因，并且具有高效的沉默作用。
以下是siRNA设计方法的一般步骤：1. **靶标基因选择**：首先需要选择目标基因进行沉默，通常选择具有重要生物学功能或致病作用的基因作为靶标。
同时需要确保siRNA的设计不会影响其他非靶基因的表达。
2. **siRNA序列设计**：siRNA通常由21-23个碱基组成，其中包括一个21核苷酸的双链RNA，通过靶向RNA干扰的方式沉默基因。
siRNA的设计应该遵循一定的规则：双链RNA的两条链中应包含完全互补的序列，同时避免长的不互补区域，确保siRNA的特异性和稳定性。
3. **siRNA序列选择**：合适的siRNA序列应该选择在目标基因的CDS（编码序列）区域或3'UTR（3'非翻译区）中，并避免包含SNP（单核苷酸多态性）位点。
另外，还需要考虑siRNA的GC含量、互补度、RNA结构和启动子序列的选择。
4. **siRNA序列验证**：设计好的siRNA序列需要进行in silico验证，通过生物信息学工具对siRNA序列进行筛选，评估其在靶标基因上的特异性和效果。
同时，也可以进行小规模的细胞实验验证siRNA的沉默效果和毒性。
5. **合成siRNA**：验证通过的siRNA序列可以通过化学合成的方式合成siRNA，通常采用化学修饰的方式增强siRNA的稳定性和靶向性。
合成的siRNA 可以直接用于细胞的转染实验。
总的来说，siRNA的设计方法需要结合基因的特性、siRNA的序列规则和生物信息学的方法进行综合考虑，以确保siRNA的特异性和高效性。
通过合理的siRNA设计方法，可以实现对特定基因的沉默，为基因功能研究和治疗疾病提供重要的工具。
SiRNA序列的设计
SiRNA序列的设计RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.1 siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
1.2 siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
以AA N19 标准设计的siRNA，在哺乳动物细胞中70%～80%可产生RNAi 作用。
但是一些具有较小脱靶效应的siRNA序列不是以AA为起始的，所以现在不推荐以“AA为起始”作为选择标准之一[6]。
最新研究表明[7,8] ，27 nt或29 nt的siRNA与21 nt siRNA相比：（1）其抑制活性可提高数倍以上；（2）不易于诱导干扰素反应和激活PKR；（3）一些基因对21 nt siRNA不敏感，但是可以被27 nt siRNA有效的抑制；（4）与21 nt SiRNA相比，27 nt SiRNA对靶基因的最大抑制率可在相对低的浓度下得到。
sirna设计原理
sirna设计原理小伙伴们！今天咱们来唠唠siRNA设计原理这个超有趣的事儿。
咱先得知道啥是siRNA。
简单说呢，siRNA就像是细胞里的小特工，专门去对付那些捣乱的基因。
它是一种双链RNA分子，长度不长不短，大概20 - 25个核苷酸左右。
这个长度可很有讲究哦。
你想啊，如果太短了，就像小短腿去追坏人，根本够不着目标；要是太长了呢，又容易拖泥带水，在细胞里施展不开手脚。
那怎么设计出有效的siRNA呢？这就像给小特工定制一套完美的装备。
首先得从基因序列下手。
我们要找的是基因的那些关键部位，就好比是坏人的弱点。
一般来说，要找那些相对特异的区域。
如果选的区域在很多基因上都有类似的，那就糟糕啦，小特工可能就认错目标，开始乱打一气了。
这就好比你要抓小偷，结果抓错成了路人甲，多尴尬呀。
而且哦，在基因序列里，有些地方是比较容易被小特工结合的，就像有些地方是小偷爱出没的角落。
这些地方的核苷酸组成有一定的特点。
比如说，GC含量就很重要。
GC含量不能太高也不能太低。
要是GC含量太高了，就像给小特工设置了一个超级复杂的密码锁，它很难解开然后去和目标结合；要是GC含量太低呢，又像是锁太简单，容易被其他不相干的东西干扰。
通常啊，GC含量在30% - 70%之间是比较理想的范围。
这就像是 Goldilocks原则，不多不少刚刚好。
再说说这个双链结构。
siRNA的双链可不是随随便便就形成的。
两条链之间的互补性要足够好。
这就像两个人跳舞，得配合得默契才行。
如果两条链之间互补性不好，就像跳舞的时候老是踩对方的脚，这个siRNA就不稳定，在细胞里还没发挥作用可能就散架了。
而且两条链的末端结构也有说法。
一般来说，末端要是平端或者有一点突出，就像小特工的武器有不同的造型，不同的末端结构会影响它和细胞里其他分子的相互作用。
另外呢，在设计siRNA的时候，还得考虑细胞环境这个大舞台。
细胞里可是一个超级复杂的世界，有各种各样的分子在跑来跑去。
sirna制剂开发指导原则
以下是针对siRNA制剂开发的一些指导原则：
1. 靶向性：确保siRNA能够准确地靶向到目标基因。这可以通过设计合适的siRNA序列沉默。
2. 有效性：确保siRNA能够有效地抑制目标基因的表达。这可以通过优化siRNA的序列和 化学修饰，以提高siRNA的稳定性和递送效率。
3. 安全性：确保siRNA制剂对人体安全。这包括避免非特异性的副作用和免疫反应，以及 减少对非目标基因的影响。
sirna制剂开发指导原则
4. 递送系统：选择合适的递送系统来将siRNA引导到目标细胞内。递送系统可以是载体、纳 米粒子或其他递送工具，能够保护siRNA免受降解，并促进其进入细胞。
5. 稳定性：确保siRNA在体内具有足够的稳定性，以便能够在适当的时间和地点发挥作用。 这可以通过化学修饰siRNA的末端或链上碱基来增强其稳定性。
6. 适当的剂量：确定适当的siRNA剂量，以实现理想的基因沉默效果，同时避免毒副作用。
7. 临床可行性：考虑siRNA制剂的临床可行性，包括制备工艺的可扩展性、成本效益以及适 用于不同疾病类型的广泛应用性。
sirna制剂开发指导原则
这些指导原则可以帮助研发人员设计和开发具有高效性、安全性和稳定性的siRNA制剂， 以实现基因沉默的治疗效果。然而，siRNA制剂的开发是一个复杂的过程，需要综合考虑多 个因素，并进行充分的实验验证和临床试验。
siRNA
对肿瘤抑制蛋白基因P53的siRNA设计摘要 (3)前言 (3)一、siRNA作用机制 (3)二、siRNA设计原理与规则 (3)1、siRNA反义链5’末端碱基设计、siRNA正义链设计、G/C比例 (3)2、siRNA目的位置二级结构预测提高siRNA效率 (4)3、内部重复序列 (4)三、对P53的siRNA设计过程 (4)1、设计大致步骤 (4)2、在GenBank数据库获取P53序列 (4)3、两种软件上的设计 (5)参考文献 (8)摘要：siRNA干扰技术作为一种新型的基因沉默技术，因其具有高校、高特异性、低毒性等优点，应用siRNA干扰技术开发新型的靶向药物，已成为药物研究领域中重点发展方向之一。
因此，了解siRNA干扰技术对未来药物领域学习有至关重要的作用。
本文是利用NCBI的基因库(GeneBank)及两种计算机辅助设计软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并对方法和结果进行分析比对。
前言：RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。
其中siRNA是RNAi发挥效应所必需的因子，因此掌握siRNA实验和设计方法非常重要。
关于设计siRNA目前尚无可靠的规律，不过，不少实验室和科研机构都开发了相应的siRNA设计软件。
设计siRNA设计是一个需要由软件完成的工作，接下来，我将用这两种软件对肿瘤抑制蛋白基因P53进行siRNA设计，并进行分析。
一、siRNA作用机制小干扰RNA作为与RNA干扰现象紧密相连的非编码RNA之一，是后基因组时代的重要研究工具。
其作用机制首先是进入体内的siRNA双链解开，引导链（指siRNA反义链）进入RNA介导的沉默复合体（RISC），并切断具有序列特异性的mRNA，切断部位大约在与反义链配对序列的中部，然后靶mRNA进一步降解。
二、siRNA设计原理与规则RNAi作用的成功与否，关键在于siRNA序列的结构。
sirna序列 写法
sirna序列写法
设计siRNA时，应遵循以下原则：
1. 从靶起始密码子下游50~100bp处开始向下游寻找腺嘌呤双核苷酸序列，将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸作为siRNA序列设计模板。
5'和3'非编码区和起始密码子附近区域应尽量避免，因为这些区域是调节蛋白的结合位点，或翻译起始复合物结合区域，它们可能对RISC复合物的形成
造成干扰，而削弱RNAi的作用。
2. siRNA的G和C碱基含量最好在50%左右（30%~70%），尽量避免GGG的出现，以影响siRNA的解链，降低RNAi的效应。
3. 在EST和NCBI数据库使用Blast程序查找所设计的靶基因是唯一的。
设计完siRNA后，可以通过网站进行查询，例如赛默飞公司的siRNA设计网页（Invitrogen Block-iT RNAi Designer）或者sigma网站用于初步查
询拟设计siRNA的核苷酸序列。
以上内容仅供参考，如需了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
siRNA 使用说明(两篇)
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
sirna序列 写法 -回复
sirna序列写法-回复Sirna序列写法Sirna （small interfering RNA）是一类短小的RNA分子，通过干扰RNA 转录或者翻译过程来沉默靶向mRNA的基因表达。
这种技术已经广泛应用于基因沉默和功能研究领域。
在这篇文章中，我将详细介绍Sirna序列的写法，从基本概念到实验步骤，希望能给读者提供一个全面的了解。
首先，Sirna序列的写法需要选择一个目标基因，然后设计Sirna分子来靶向这个基因。
在设计时，我们需要考虑以下几个方面：1.选择合适的靶点：首先，我们需要选定一个合适的靶点，这个靶点应该在目标基因的mRNA 序列中，并且尽量选择在编码区域。
靶点的选择应尽量避免与其他基因的序列相似，以减少非特异性靶向效应。
2.确定靶点的位置：确定了靶点后，我们需要确定该靶点的具体位置。
为了提高靶向效应，通常选择在目标基因的首个1/3区域进行靶向。
3.设计合适的Sirna序列：设计Sirna序列时，我们通常选择21-23个核苷酸长的RNA分子。
Sirna序列主要由两个部分组成，即反义链和同义链。
反义链与目标mRNA序列互补配对，而同义链与反义链互补配对形成一个完整的双链结构。
为了增加靶向效应，我们可以在反义链和同义链中间添加一个陆休核苷酸，这个陆休核苷酸的配对能力需要较差，以防止反义链和同义链之间形成稳定的二级结构。
Sirna序列的设计还需要考虑一些其他因素，如GC含量、碱基组成、doiuplex稳定性等。
这些因素可以通过一些在线工具和软件来计算和评估。
一旦设计完Sirna序列，我们就可以进行实验验证了。
下面是一些实验步骤：1.合成Sirna分子：可以通过化学合成或者基因工程方法合成Sirna分子。
在设计Sirna序列时，我们还可以选择在5'端和3'端加入某些化学修饰基团，以增强Sirna 的稳定性和递送效率。
2.转染Sirna分子：将合成的Sirna分子转染到目标细胞或组织中，以达到基因靶向沉默的效果。
(完整版)siRNA设计原则
量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
sirna序列设计原则
sirna序列设计原则引言：小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）是一种能够靶向特定基因进行沉默的小分子RNA，因其具有高度选择性和特异性，被广泛应用于基因沉默、基因功能研究和药物研发等领域。
siRNA序列的设计是siRNA研究的重要环节，合理设计的siRNA序列能够提高siRNA的稳定性和特异性，从而提高基因沉默效率。
本文将介绍siRNA序列设计的原则和方法。
一、选择靶点：siRNA的靶点应位于目标基因的mRNA序列上，通常选择在启动子区域和编码区域附近的区域。
在选择靶点时，应避免选择过于保守的区域，以免导致非特异性沉默。
二、序列长度：siRNA的长度通常为19-25个核苷酸，其中双链部分为19个核苷酸。
较短的siRNA序列易于合成和转染，较长的siRNA序列具有更好的特异性和稳定性。
三、序列设计：1. 避免GC含量过高或过低：siRNA序列的GC含量应在30-50%之间，过高或过低的GC含量可能影响siRNA的稳定性和特异性。
2. 避免重复序列：siRNA序列中应避免出现重复序列，以免产生非特异性沉默效应。
3. 避免启动子区域和剪切位点：siRNA序列的设计应避免位于启动子区域和剪切位点，以免对基因表达和剪切产生不良影响。
4. 避免稳定性差的序列：siRNA序列中应避免出现易于形成稳定二级结构的序列，以免影响siRNA的转染和沉默效率。
5. 避免T尾：siRNA序列的设计应避免在3'端以T结尾，以免被细胞内核酸酶识别并降解。
四、特异性验证：在设计siRNA序列后，应进行特异性验证以确保siRNA能够靶向特定基因进行沉默。
常用的验证方法包括荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR等。
五、合成和转染：siRNA序列的合成通常采用化学合成方法，合成的siRNA应具有较高的纯度和纯性。
转染时，siRNA应与转染试剂或载体进行复合，以提高siRNA的转染效率和沉默效率。
（完整版）siRNA设计原则
（完整版）siRNA设计原则量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA 序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
siRNA Oligo 设计软件设计原则
siRNA Oligo 设计软件设计原则1．希望软件可以在web 上使用。
即用户可以访问我们的网站，输入基因代码，即可自行在网上设计siRNA Oligo。
2．可参照的软件形式：见如下网站：3．希望能就每一个所指定的基因找到至少四对以上可合成的双链RNA oligo。
4．软件设计中的几个关键步骤如下：A．进入Gene Bank 调出指定基因序列；B．根据特定的一些规则选出一个基因片段；C．再根据一些规则写出正义和反义两段各21个碱基的序列；D．最后通过反转，替代，空格得出最后结果。
具体设计原则：1．在所选基因的启动子后50-100个碱基自5’-端开始2．寻找基因序列中的23个碱基，最好是5‘- AA（N19）TT -3’（N是任何碱基）3．如果找不到四个以上AA（N19）TT，则用AA（N21）补足。
4．如果找不到四个以上AA（N21），则用NA（N21）补足。
5．所选定序列中，G和C的数目的总和在总数（23）的35-55%. 6．满足以上1-5项要求的片段数目如果不足四个，将G和C的数目的总和放宽至总数（23）的30-70%.7．选好上述序列后，以此确定所需合成双链RNA oligo 的序列如下：8．正义序列（N19）TT 与上述选定的23 个碱基序列中的第3-23个碱基相同9．反义序列的3’----5’ 的序列与目标序列中的第1-21个碱基互补，即A变成T，C变成G，T变成A，G变成C。
10．将反义序列3’----5’ 改写成5’----3’.11．将最后所得序列中除3’- 末端的两个碱基之外的所有碱基中的T都用U来替代。
最后每三个组成一个字节，中间断开。
12．将所选定的正义序列和反义序列与gene bank 中已知同物种的基因序列进行比较，确定其唯一性（BLAST）13．上述7-10 项可见如下例子：假如通过1-5 项的条件选出的一段23 个碱基的序列是5’- AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT- 3’正义序列就应该是：5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’反义序列就应该是: 3’- TTCGATCAGTACCGGTAACTG-5’反转处理后即得：正义序列：5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’反义序列：5’- GTCAATGGCCATGACTAGCTT -3’U替代T以后得到：正义序列：5’- GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT - 3’反义序列：5’- GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT -3’段开字节后最后得到：正义序列：5’- GCU AGU CAU GGC CAU UGA CTT - 3’反义序列：5’- GUC AAU GGC CAU GAC UAG CTT -3’。
siRNA制备原则
siRNA制备方法（how to get siRNA?）adminIn vitroA.. 化学合成法Ｂ、体外转录Ｃ、酶切长链dsRNAIn vivoＤ、载体表达siRNAＥ、PCR合成siRNA表达元件A. 化学合成法1.方法简单、快速，需要时间短；获得的siRNA纯度高2.适用于短期体外实验研究，尤其适用于需要单一siRNA序列的研究3.siRNA可进行标记4.需要进行大规模的筛选来确定单一的siRNA序列5.不适用于长期研究6.不适用于siRNA序列的筛选siRNA序列设计注意事项1.选择以AA开头的19-21nt长的序列2.靶定序列从起始密码子下游75-100个nt处开始，到终止密码子上游75-100nt处结束3.选择2-4个靶定序列，以筛选特异性最好的进行实验4.选择的序列中GC含量在30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出现3 个以上G。
5.若需要发卡结构，发卡部分长度一般为6-9nt，有文献报道9nt效果较好.6.最后,选择的DNA片段经BLAST 查询,应与其它人类基因无同源性7.设定适当的对照设置适当的siRNA对照1) 与靶定siRNA有相同的碱基组成，但排列完全不同，且不与其它基因由同源性AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6)ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6)2)1-2碱基错配的siRNA对照(1-2nt)AGCCTTAGCTTAAGTCCTAGAGCCTTAG T TTAA A TCCTAG T 和A错配siRNA序列设计根据文献报道，使用确定的siRNA序列许多网站提供siRNA设计软件，只需输入靶定基因序列，即可提供候选siRNA序列；比如Ambion公司,武汉晶赛B、体外转录合成短的siRNA1.T7 RNA 聚和酶体外转录DNA，直接产生小片断的siRNA，2.快速、灵活，适用于siRNA序列的筛选以及化学合成siRNA价格昂贵时3.siRNA可进行标记4.可重复性差，不适用于长期研究和需要大量单一siRNA序列的研究( 使用T7 RNA 聚合酶需要转录的RNA前两个核苷酸为GG or GA 以保证高的合成效率(Milligan 1987). 在siRNA的5‘ 需要是GG or GA 序列，同时在3’端又需要有两个UU ；这就极大的减少了可能的siRNA的靶位点这些限制了体外转录作为产生siRNAs稳定的方式) (体外合成一段目的基因的寡核苷酸（有义链和反义链），其3‘端含有8个碱基与Ｔ７启动子序列互补；将Ｔ７启动子与模板混合，Ｋｌｅｎｏｗ酶补平，使用Ｔ７ＲＮＡ酶进行转录。
如何在线设计siRNA？
如何在线设计siRNA？今天我们来学学siRNA的设计1. siRNA原理siRNA为small interfering RNA的缩写，siRNA与靶向特异性的mRNA结合，通过RNA介导的沉默复合体RISC（RNA-induce siliencing complex）介导mRNA的降解。
siRNA长度一般为21-23nt，被RISC识别结合之后，siRNA发生解旋。
然后RISC在siRNA 的反义链指导下，寻找具有同源序列的内源性的mRNA，并在距离5’端10-11位剪辑之间切割mRNA，从而导致转录后基因沉默。
siRNA的原理如下：也可以来看一看RNAi的视频介绍：2. siRNA设计原则RNAi发挥作用的核心在于siRNA的序列结构，因此不同的siRNA 导致的沉默效果差异非常巨大。
影响siRNA功能因素主要包括siRNA 序列结构特点、靶向mRNA的空间结构、RISC与siRNA的相互作用、以及siRNA与mRNA错配。
目前siRNA设计的原则有两种方式：(1) 统计不同siRNA对靶序列抑制程度得到siRNA设计原则。
这个原则就是统计目前已有的siRNA序列，根据序列特点和序列沉默效果分析得到。
a. GC含量在30%-52%b. 有义链15-19位至少有3个A或者Uc. 避免出现倒置重复，以防形成发卡结构d. 有义链的第3位核苷酸为Ae. 有义链的第10位核苷酸为Uf. 有义链的第19位核苷酸为Ag. 有义链的第19位核苷酸不能为G或Ch. 有义链的第13位核苷酸不能为G(2) 以siRNA序列上的能量为依据，筛选有效序列。
a. 总的siRNA双联能量<>b. 反义链5'端的结合能<>c. 有义链的5'端结合能在5-9e. GC含量在36%-53%f. 中间7-12位的结合能<>g. 反义链5’端与正义链5'端的能量差最好在-1~03. siRNA设计步骤首先选择一个靶基因的目的片段位置，并显示出代表性的siRNA 序列；其次从候选的siRNA中排除含有SNP位点的和位于非开放阅读框架的片段；接下来去除一些不利siRNA序列，如简并碱基、毒性结构域、重复序列、高GC/低GC序列；然后从热烈学、高级结构等打分，列出从高到低的序列；随后将siRNA片段进行Blast分析，去除非特异结合的序列；最后预设计几条siRNA序列4. siRNA在线设计网址siRNA有很多在线设计工具。
RNAi片段siRNA设计原则
RNAi片段siRNA设计原则RNAi 目标序列的选取原则应遵循以下几个方面的原则：(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。
有研究结果显示GC 含量在45%-55%左右的siRNA 要比那些GC 含量偏高的更为有效。
Tuschl 等建议在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA 的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST 同源的序列。
例如使用BLAST(3)选出合适的目标序列进行合成。
通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
(4)一个目标基因至少设计3-5个以上的siRNA，平行实验以期提高成功率。
据评估，随机设计的siRNA有25%的机会有效沉默基因表达（减少75%-95%以上的mRNA），一半以上的几率能达到50%的沉默效果。
(5) siRNA的反义链3’端最好以UU结尾，这被公认是最有效的siRNA 结构。
现在以其他碱基结尾的siRNA也有报道能成功引发RNAi。
以下为一些文献中提出的原则补充，很不错。
General Guidelines1.siRNA targeted sequence is usually 21 nt in length.2.Avoid regions within 50-100 bp of the start codon and thetermination codon3.Avoid intron regions4.Avoid stretches of 4 or more bases such as AAAA, CCCC5.Avoid regions with GC content <30% or > 60%.6.Avoid repeats and low complex sequence7.Avoid single nucleotide polymorphism (SNP) sites8.Perform BLAST homology search to avoid off-target effects onother genes or sequences9.Always design negative controls by scrambling targeted siRNAsequence. The control RNA should have the same length andnucleotide composition as the siRNA but have at least 4-5 basesmismatched to the siRNA. Make sure the scrambling will not create new homology to other genes.Tom Tuschl's rules1.Select targeted region from a given cDNA sequence beginning50-100 nt downstream of start condon2.First search for 23-nt sequence motif AA(N19). If no suitablesequence is found, then,3.Search for 23-nt sequence motif NA(N21) and convert the 3' endof the sense siRNA to TT4.Or search for NAR(N17)YNN5.Target sequence should have a GC content of around 50%A = Adenine; T = Thymine; R = Adenine or Guanine (Purines); Y =A sum score of 6 defines the cutoff for selecting siRNAs. All siRNAs scoring higher than 6 are acceptable candidates.*Tm = 79.8 + 18.5*log10([Na+]) + (58.4 * GC%/100) + (11.8 * (GC%/100)2) - (820/Length)For example, the Tm can be calculated as follows for the siRNA UUCUCCAGCUUCUAAAAUATm = 79.8 + 18.5*log10(0.05) + (58.4 * 31.6/100) + (11.8 * (31.6/100)2) - (820/19)Tm = 32.19There are two siRNA design tools which implement this siRNA design algorithm: one is offered by Dharmacon, Inc; the other is a downloadable Excel template, written by Maurice Ho att.hk/RNAi/siRNA.References1.Elbashir SM et al. (2001) Duplexes of 21-nucleotide RNAsmediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature.411:494-498.2.Elbahir SM et al. (2001). Functional anatomy of siRNAs formediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate.EMBO J. 20:6877-6888.3.Elbashir SM et al. (2002). Analysis of gene function in somaticmammalian cells using small interfering RNAs. Methods.26:199-213.4.Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall WS,Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. NatBiotechnol. 2004 Mar;22(3):326-30.5./biotools/oligocalc.html6.Maurice Ho, Rational siRNA DesignRNAi target selection rules:1.Targeted regions on the cDNA sequence of a targeted geneshould be located 50-100 nt downstream of the start codon (ATG).2.Search for sequence motif AA(N19)TT or NA(N21), orNAR(N17)YNN, where N is any nucleotide, R is purine (A, G) and Y is pyrimidine (C, U).3.Avoid targeting introns, since RNAi only works in thecytoplasm and not within the nucleus.4.Avoid sequences with > 50% G+C content.5.Avoid stretches of 4 or more nucleotide repeats.6.Avoid 5URT and 3UTR, although siRNAs targeting UTRs havesuccessfully induced gene inhibition.7.Avoid sequences that share a certain degree of homology withother related or unrelated genes.How to obtain a cDNA sequence for target selectionBefore finding a RNAi target on the gene of your interest, first you have to get its mRNA sequence or sequence accession number as some siRNA design tools can take accession number as input. It is recommended to use the gene's RefSeq from NCBI, since the RefSeq represents non-redundant, curated and validated sequences. RefSeq mRNA sequences have unique accession numbers which start with NM or XM, followed by 6 digits. For example, NM_123456 (curated mRNA sequence) or XM_0123456 (model mRNA sequence predicted by genome sequence analysis). There are several ways of querying RefSeq.1.Search LocusLink by gene name or symbol at/LocusLink/. Once the locus of yourgene is found, scroll down to the "NCBI Reference Sequence(RefSeq)" section and look for mRNA.2.Search Entrez Gene at/entrez/query.fcgi?db=gene, and select the right gene of desired organism. Once the page for the gene is shown, scroll down to the "NCBI Reference Sequence (RefSeq)"and look for mRNA.3.Search Nucleotide database using Entrez query toolat /entrez/query.fcgi?db=Nucleotide and use Entrez Limits settings to restrict your query to the RefSeq database onlyo select "RefSeq" from the "Only from" menu, this restricts the query to the RefSeq collectiono select "mRNA" from the "Molecule" menu, this restricts the query to mRNA RefSeq recordsHomology searchThe RNAi targeted region on the mRNA sequence of a gene should not share significant homology with other genes or sequences in the genome, therefore, homology search is essential to minimizeoff-target effects. Although most siRNA design tools provide BLAST option, some simply use NCBI BLAST tools which sometimes are quite slow. Here are some BLAST tools for homology search.•NCBI Blast tool: Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn) or Search for short, nearly exact matches•Blat tool on UCSC Genome Website/cgi-bin/hgBlat•Ensembl Blast /Multi/blastview Examples of RNAi target selectionReferences1. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8.2. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001 Jan15;15(2):188-200.。
siRNA设计原则
量实验表明，针对同一靶基因的不同siRNA序列具有不同的沉默效率，为了能够运用RNAi技术更有效地沉默靶基因，需要在RNAi的第一步，也是其成功与否的关键环节―siRNA序列的设计方面进行更多的改进。
本文将在以下几个方面探讨siRNA序列设计方面的最新研究进展，作为应用RNAi技术时的参考。
RNAi最终要通过siRNA片段与靶基因结合并使之降解，因此，确保高度同源于靶基因而绝无与其他基因同源的siRNA序列，是决定RNAi特异性的关键所在，也是siRNA设计的基本原则。
从具有不同沉默效率的siRNA序列中筛选出高效的siRNA序列，需要经过严密的设计和不断的实验检验[1]。
1.siRNA序列在靶基因中的位置从靶基因起始密码子AUG下游50～100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好[2]。
以前的研究表明：不要以5′非翻译区（5′UTR）和3′非翻译区（3′UTR）及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板，这些区域含有调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物)，调节蛋白可与RISC竞争结合siRNA序列，降低RNAi效应[3]；也要避开外显子与外显子的交界区域和单核苷酸多形性(SNP)区域。
最近，Yokota等发现在HCV(丙型肝炎病毒)基因组中，5′UTR是一个高度保守区，使之成为siRNA理想的靶点。
运用RNAi技术作用于5′UTR或3′UTR序列，同样可引起靶基因沉默[4,5]，这些发现使基因功能分析领域扩展到5′UTR和3′UTR内。
2. siRNA序列的起始碱基与长度SiRNA序列最好为AA(N n)UU(N 代表任意碱基；n为碱基数目，在19～29 nt之间)，NA(N n) UU和NA(N n) NN序列也可以。
以前的研究表明，典型siRNA 的三大结构特征是：长度为21～23 nt；siRNA双链的3′端各有两个突出碱基；siRNA双链的5′端有磷酸基团。
siRNA——精选推荐
siRNA对肿瘤抑制蛋⽩基因P53的siRNA设计摘要 (3)前⾔ (3)⼀、siRNA作⽤机制 (3)⼆、siRNA设计原理与规则 (3)1、siRNA反义链5’末端碱基设计、siRNA正义链设计、G/C⽐例(3)2、siRNA⽬的位置⼆级结构预测提⾼siRNA效率 (4)3、内部重复序列 (4)三、对P53的siRNA设计过程 (4)1、设计⼤致步骤 (4)2、在GenBank数据库获取P53序列 (4)3、两种软件上的设计 (5)参考⽂献 (8)摘要：siRNA⼲扰技术作为⼀种新型的基因沉默技术，因其具有⾼校、⾼特异性、低毒性等优点，应⽤siRNA⼲扰技术开发新型的靶向药物，已成为药物研究领域中重点发展⽅向之⼀。
因此，了解siRNA⼲扰技术对未来药物领域学习有⾄关重要的作⽤。
本⽂是利⽤NCBI的基因库(GeneBank)及两种计算机辅助设计软件对肿瘤抑制蛋⽩基因P53进⾏siRNA设计，并对⽅法和结果进⾏分析⽐对。
前⾔：RNA⼲扰(RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA⽔平关闭相应基因表达的过程。
其中siRNA是RNAi发挥效应所必需的因⼦，因此掌握siRNA实验和设计⽅法⾮常重要。
关于设计siRNA⽬前尚⽆可靠的规律，不过，不少实验室和科研机构都开发了相应的siRNA设计软件。
设计siRNA设计是⼀个需要由软件完成的⼯作，接下来，我将⽤这两种软件对肿瘤抑制蛋⽩基因P53进⾏siRNA设计，并进⾏分析。
⼀、siRNA作⽤机制⼩⼲扰RNA作为与RNA⼲扰现象紧密相连的⾮编码RNA之⼀，是后基因组时代的重要研究⼯具。
其作⽤机制⾸先是进⼊体内的siRNA双链解开，引导链（指siRNA反义链）进⼊RNA介导的沉默复合体（RISC），并切断具有序列特异性的mRNA，切断部位⼤约在与反义链配对序列的中部，然后靶mRNA进⼀步降解。
⼆、siRNA设计原理与规则RNAi作⽤的成功与否，关键在于siRNA序列的结构。
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8条与siRNA功能相关的原则：
1.GC含量30%-52%
2.sense链的15-19碱基中至少含有3个A/U
3.不含有反向重复序列
4.sense链的第19碱基为A
5.sense链的第3碱基为A
6.sense链的第10碱基为U
7.sense链的第19碱基不是G/C
8.sense链的第13碱基不是G
同时满足以下四点的siRNA能够达到较高的基因沉默效果：
1.antisense的5’端为A/U
2.sense的5’端为G/C
3.antisense的5’端的7个碱基中至少有5个A/U
4.siRNA序列中没有连续9个以上的GC片段
分析得到六个与基因沉默功能相关的siRNA序列特点：
1.sense链’5’与3’端的3个碱基中A/U含量不对称。
2.sense链的第1个碱基为G/C
3.sense链的第6个碱基为A
4.sense链的第19个碱基为A/U
5.sense链的第1个碱基不是U
6.sense链的第19个碱基不是G
另外，GC含量在31.6%-57.9%
文中指出，明显有效的siRNA序列需要满足3’端的3个碱基中A/U数量比5’端的3个碱基中A/U数量至少多1个，而且至少满足第2，3，4点中的两点。