补肾益聪汤对2型糖尿病耳聋大鼠耳蜗毛细胞硫氧还原蛋白基因表达的影响

CJCM中医临床研究2021年第13卷第4期-7-
补烽益聪汤对2型糖尿病耳弹大鼠耳蜗毛细胞
硫氧还原蛋白基因表达的影响The efficacy of the Bushen Yicong decoction on Trx gene expression
in cochlear hair cells of type2diabetic deaf rats
张岳唐年亚
(南阳医学高等专科学校，河南南阳，473000)中图分类号：R259文献标识码：A文章编号：1674-7860(2021)04-0007-04证型：DGB
【摘要】目的：探讨补肾益聪汤对2型糖尿病(I\pe2Diabetes Mellitus,T2DM)耳聋大鼠耳蜗毛细胞硫氧还原蛋白(Thioredoxin,Trx)基因表达的影响及其作用机制。

方法:将成年SD大鼠60只随机分为空白组、模型组、对照组和中药低、中、高剂量组。

采用腹腔注射小剂量链豚佐菌素(Streptozotocin,STZ)和高热量饲料喂养诱导T2DM动物模型，空腹血糖(Glucose, GLU)11.1mmol/L且听觉脑干诱发电位(Auditory Brainstemresponse,ABR)阈值^40dBnHL入选为T2DM耳聋大鼠模型。

对照组灌服格列齐特悬混液和甲钻胺悬混液；中药低、中、高剂量组分别灌服不同剂量补肾益聪汤。

分别于大鼠造模后、给药4周、给药8周和给药12周后,测量GLU、ABR；给药12周后，酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)测定大鼠血清中超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性和Real-time PCR定量检测大鼠耳蜗中Trx基因表达水平。

结果：对照组和中药低、中、高剂量组大鼠GLU和ABR听阈较模型组均明显降低(P<0.05),其中对照组短期降糖效果优于其他各组(PV0.01),中药高剂量组持续性降糖和降低阈值效果最佳(PV0.01)；对照组和中药低、中、高剂量组均能提高大鼠血清中SOD的活性和大鼠耳蜗中Trx基因表达水平(P<0.01),其中以中药中、高剂量组效果最佳(PV0.01)。

结论：补肾益聪汤通过持续改善T2DM耳聋的高糖状态以及提升机体抗氧化能力，减少耳蜗毛细胞氧化损伤，提高耳蜗中Trx基因表达水平，以达到治疗T2DM耳聋的目的。

【关键词】补肾益聪汤；糖尿病耳聋；Trx基因
[Abstract]Objective:To investigate the effect and mechanism of the Bushen Yicong decoction(补肾益聪汤)on Trx gene expression in cochlear hair cells of T2DM deaf rats.Methods:60SD rats were randomly divided into the blank group,the model group,the control group and the TCM low dose group,the TCM middle dose group and the TCM high dose group.T2DM model of animals were induced by low dose STZ intraperitoneal injection and high-calorie feed.The rats which GLUM11.1mmol/L and ABR threshold^40dBnHL were selected as the T2DM deaf rats model.The control group was given gliclazide and mecobalamin mixed suspension byirrigation.The TCM groups were separately given the Bushen Yicong decoction of different doses.The GLU and ABR were measured after model-making,4 weeks,8weeks and12weeks,the levels of SOD activity and Trx geneexpression were measured after12weeks.Results:The GLU and ABR thresholds in the control group and the TCM groups were significantly lower than those in the model group;the short-term hypoglycemic effect in the control group was better than other groups.The TCM high dose group showed the best continuous hypoglycemic and threshold reduction effect.The control group and the TCM groups can improve the activity of SOD in serum and the expression level of Trx gene in cochlear hair cells of rats,and the best effect was in the TCM middle dose group and the TCM high dose group.Conclusion:The Bushen Yicong decoction can continuously ameliorate the high glucose status ofT2DM deafiiess and enhance the body's antioxidant capacity,reduce the oxidative damage of cochlear hair cells,and increase Trx gene expression in the cochlear hair cells to treat T2DM deafiiess.
(Keywords】The Bushen Yicong decoction;T2DM deafness;Trx gene
doi:l0.3969/j.issn.l674-7860.2021.04.002
T2DM耳聋是一种以高频听力损伤为主，耳蜗外毛细胞散在缺失为特征的感音神经性耳聋。

T2DM长期持续的髙血糖状态，使机体抗氧化能力减弱，氧化应激反应发生，是导致耳蜗细胞损伤的重要原因。

T2DM会导致患者出现耳聋耳鸣等系列症状，随病程延长，血糖控制效果欠佳，患者表现为严重的听力下降。

目前T2DM耳聋的发病机制尚不明确％且无法治愈，给临床防治糖尿病性耳聋带来了极大困难。

硫氧还原蛋白是人体内最主要的抗氧化剂之一眄在抗氧化和抑制细胞凋亡方面起着关键的作用。

因此，课题组从Trx基因表达的角度，观察补肾益聪汤对T2DM耳聋大鼠耳蜗毛细胞损伤的影响，探索T2DM耳聋防治的新思路。

1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1动物与分组
选取成年SD大鼠60只，雌雄各半，体质量180〜220g,
Clinical Journal of Chinese Medicine2021Vol.(13)No.4
由河南省实验动物中心提供，许可证号：SCXK（豫）2017-0001o所有大鼠均要求耳廓反射灵敏，电耳镜检查鼓膜完整，光锥清晰。

将60只SD大鼠分为空白组（10只）和造模组（50只），待造模成功后，造模组随机分成模型组、对照组、中药低、中、高剂量组，每组各10只。

1.1.2实验试剂
STZ购自Sigma公司，货号S0130,用0.1mol/L柠檬酸缓冲液配制成5mg/mL的STZ溶液，现用现配；SOD试剂盒：南京建成生物工程研究所；血糖仪、血糖试纸：罗氏公司；Trx：美国Sigma公司。

1.1.3实验药物
补肾益聪汤：由葛根、黄黃、丹参、川茸、枸杞子、生地黄、当归、桂枝、白芍、柴胡、甘草等药物组成，制备成浓度分别为1g/mL、2g/mL、4g/mL的低、中、高剂量浓缩中药液（南阳医专二附院提供）；格列齐特片：哈药集团制药总厂生产，国药准字H10983143,80mg/片，制作成浓度5mg/mL 的悬混液；甲钻胺片：江苏迪赛诺制药有限公司生产，国药准字H20052564,0.5mg/片，制作成浓度0.03mg/mL的悬混液。

1.2实验方法
1.2.1造模方法
釆用腹腔注射小剂量STZ和高热量饲料（基础饲料/蔗糖/炼猪油/奶粉=6.5/0.5/2.505）喂养诱导T2DM动物模型。

先用高热量饲料喂养4周后，一次性腹腔注射STZ（40mg^g）,继续高热量饲料喂养8周后，以GLU N11.1mmol/L,且ABR阈值》40dBnHL入选为T2DM耳聋大鼠模型。

1.2.2用药方法
按照体表面积折算动物（大鼠）有效计量：中药低、中、高剂量组灌服剂量为成人的3倍、6倍、12倍；对照组灌服剂量为成人的6倍；空白组和模型组灌服中剂量等容生理盐水。

空白组和模型组：灌服生理盐水，每只2mL,每天1次；对照组：灌服格列齐特悬混液每天25mg/kg和甲钻胺悬混液每天0.15mg/kg；中药低、中、髙剂量组：分别灌服补肾益聪汤每天lOg/kg、每天20g/kg和每天40g/kg。

各组用药时间均为12周。

1.3实验仪器
血糖测定仪（罗氏）；脑干诱发电位测听仪（美国GSI）；酶标仪（雷杜）；实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad）。

1.4检测指标
分别于大鼠造模后、给药4周、给药8周和给药12周后，测量以下指标:①GLU测定:釆尾尖血，釆血前一天禁食12h,利用罗氏血糖仪和血糖试纸检测大鼠GLU水平;②ABR测定：10%水合氯醛腹腔注射，电针穿刺大鼠颅骨骨膜，行大鼠听阈测试。

给药12周，末次灌胃后lh将全部大鼠给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉5min,③SOD活性测定：眼眶取血2mL,离心并获得血清，严格按照试剂盒操作标准，釆用黄嚓吟氧化酶法（ELISA法）测定各组大鼠血清中SOD活性；④Trx 基因表达：处死动物，在解剖显微镜下，解剖剪开颅，耳蜗解剖皿经DEPC水处理，迅速打开听泡，取出耳蜗，Real-time PCR定量检测Trx基因表达水平，提取总RNA弓幽序列如下：Trx引物：上游CAAATGCATGCCGACCTTCCAGTT,下游TGGCAGTTGGGTATAGACTCTCCA目的片段长度130bp；GAPDH引物：上游TGTGATGGGTGTGAACGACGAGAA,下游GAGCCCTTCCACAATGCCAAAGTT目的片段长度208bp。

1.5统计学方法
数据釆用SPSS17.0统计软件，各组数据均以（元土S）表示，结果用单因素方差分析，组间比较釆用『检验，P< 0.05示差异有统计学意义，P<0.01示显著性差异。

2结果
2.1补肾益聪汤对各组大鼠GLU水平的影响
与空白组比较，造模后各组大鼠血糖均显著上升（GLU M11.1tnmoVL）且能维持较长时间，提示T2DM大鼠造模成功（造模后，P<0.01）；与模型组比较，用药4〜12周，对照组和中药高剂量组大鼠血糖均明显降低（PV0.01）,第4周时对照组降糖效果明显优于中药高剂量组（P<0.01）,但第8~12周对照组减糖效果下降，中药低、中剂量组呈现降糖效果（P<0.01）；第12周，中药低、中、高剂量组降糖效果显著（P<0.05）,以中药高剂量组降糖效果最佳，见表1。

表1造模后及给药4周、给药8周和给药12周后各组2型糖尿病耳聋大鼠血糖的变化（元土S,mmol/L）
组别鼠数造模后给药4周给药8周给药12周空白组10 4.84土0.53" 4.73土0.66” 4.81±0.48** 4.80±0.72**模型组1017.12+1.02AA17.95+0.89AA18.85+0.72AA19.85+0.61AA 对照组1017.35+0.79AA744土0.62”10.50±1.24**14.44土1.87"
中药低剂量组1017.23+0.88AA16.78±0.78—14.18+1.72*•—13.02+1.42**-中药中剂量组1017.35+0.65AA15.45土2.20—12.34土1.62"11.27±1.72*•—中药高剂量组1017.37+0.80AA13.29+1.44**—10.64+1.19**9.28+1.59**—注：与空白组比较,A P<0.05,△△PV0.01；与模型组比较,7V0.05,**P<0.01；与对照组比较，-P<0.05,—PV0.01。

2.2补肾益聪汤对各组大鼠ABR阈值的影响
与空白组比较，造模后各组大鼠ABR阈值均显著上升（ABR阈值M40dBnHL）,且能维持较长时间，提示T2DM 耳聋大鼠造模成功（造模后，P<0.01）…与模型组比较，用药4~12周后，对照组和中药中、高剂量组ABR阈值均出现降低（P<0.05）；用药8周后，中药低剂量组ABR阈值降低（P<0.01）；用药12周后，对照组和中药低、中、髙剂量组ABR阈值均明显降低（P<0.01）；其中以中药高剂量组效果最佳，见表2。

CJCM中医临床研究2021年第13卷第4期-9-表2造模后及给药4周、给药8周和给药12周后各组2型糖尿病耳聋大鼠ABR阈值的变化(元土S,dBnHL)
组别鼠数造模后给药4周给药8周给药12周空白组1010.10±1.10**10.00±0.94**9.70±1.42**10.00±1.33**模型组1044.10±2.60aa48.9±2.33AA53.90±3.35△△60.10±3.38AA 对照组1046.10+2.42AA45.10土3.87"42.80±3.94"37.70土3.30"
中药低剂量组1045.20±3.91AA47.10土3.4543.50±2.37**43.80+4.89**中药中剂量组1045.20±3.71aa46.00±3.06*41.40+2.46**37.30±2.58**中药高剂量组1043.90±3.84AA45.10±2.92**38.60±3.47"—31.60±3.57**—注：ABR：听觉脑干诱发电位。

与空白组比较，Apvo.05,AA P<0.01；与模型组比较'P<0.05,"P<0.01；与对照组比较，~P<0.05,—p v o.oi。

2.3补肾益聪汤对各组大鼠血清中SOD活性和耳蜗Trx基因表达水平的影响
与空白组比较，模型组大鼠SOD活性和Trx基因表达水平显著下降(P<0.01)。

与模型组比较，对照组和中药低、中、高剂量组均能提高SOD的活性和Trx基因表达水平(P< 0.01),其中以中药中、高剂量组效果最佳，见表3。

表3补肾益聪汤对各组2型糖尿病耳聋大鼠血清中SOD活性和耳蜗TTx基因表达水平的影响(元土S)
组别鼠数SOD/(IU/mL)Trx基因表达水平空白组10110.25±9.29"0.78±0.05"
模型组1073.25±7.56△△0.05+0.03△△
对照组1087.63±7.28△△”0.32±0.02AA**
中药低剂量组1093.14±5.77△△”0.28±0.02
中药中剂量组1096.48±6.990.39±0.01
中药高剂量组1099.54土6.32△△杯—0.41±0.02AA**—注：SOD：超氧化物岐化酶；Tix：硫氧还原蛋白。

与空白组比较,仃<0.05,aap<0.01；与模型组比较，'P<0.05,“P<0.01；与对照组比较，-PV0.05,—PV0.01。

3讨论
1857年Jordao首先报道感音神经性耳聋与糖尿病相关。

T2DM耳聋由于糖基化终产物增加，机体抗氧化能力减弱，促进氧化应激反应发生切。

糖尿病长期高糖状态下，体内多元醇代谢通路活性增强，多元醇代谢紊乱，超氧自由基产生过多，清除氧自由基的酶如SOD等，因非酶糖基化反应而活性降低，对清除自由基的作用下降。

糖不能被氧化分解，非酶糖基化终产物生成增多，破坏血管内皮屏障，造成内皮损伤，通透性增加，神经营养性供血减少，从而进一步加剧氧化应激反应，加重氧化损伤，从而出现T2DM耳聋。

长期高血糖及其代谢产物导致的氧化应激，激活多种凋亡信号通路,造成耳蜗细胞不可逆性损害，是感音神经性耳聋发生发展的关键因素。

本实验选用SD大鼠作为实验动物，针对啮齿类动物模型听觉系统研究，选取目前最为有效和可靠的检测工具ABR测定作为听觉检测标准。

T2DM耳聋造成的听觉神经系统损伤，呈双侧对称性高频感音神经性聋，大量研究结果表明T2DM耳聋ABR阈值明显增高，且在病变早期先于形态学改变出现"1,因此ABR测定便于检测T2DM耳聋的发生和发展，以便及早采用防治措施，减轻听力损害。

从降糖效果来看，本研究结果显示，补肾益聪汤虽在早期降糖效果与对照组比较没有优势，但其在持续性降糖方面优势明显；且ABR阈值下降与血糖下降相对应。

Trx是体内一种重要的抗氧化剂眄具有强烈的清除体内过氧化物的作用，使蛋白质和细胞膜避免受到氧化损伤，并具有调节细胞因子转录和凋亡进程等作用。

在抗氧化过程中，通过与硫氧还蛋白过氧化物酶(Peroxidase,PRDX)和还原型辅酶II一起发挥作用，PRDX和其他家族成员，通过在彼此保守的Cys之间形成二硫键而二聚体化，Trx将氧化的硫氧还蛋白过氧化物酶还原成单体。

通过氧化型和还原型间的转化，Trx在维持体内氧化还原平衡起到关键作用。

本研究结果显示，补肾益聪汤能够提高SOD的活性和Trx基因表达水平，因此，我们推测补肾益聪汤可能通过提升机体抗氧化能力，减轻氧化应激反应，减少耳蜗毛细胞氧化损伤，改善T2DM 耳聋状态。

糖尿病属中医“消渴”范畴，T2DM耳聋为消渴并发耳病，起初多由燥热伤津、气阴两虚所致，消渴日久，久病必瘀，痰瘀互结，损伤耳络。

治宜补肾通络，化痰祛瘀。

肾藏精，开窍于耳，肾精充足方能滋养耳窍，耳聪则能听，因此,本病治疗应重在补肾，补中有通，痰瘀共治。

根据病因病机,补肾益聪汤采用枸杞子、丹参、葛根、黄罠、川茸、生地黄、半夏、当归、桂枝、白芍、柴胡、甘草共奏补肾养阴，益气豁痰，祛瘀通络之功效。

方中枸杞子、黄黃、生地黄为君药,补肾养阴益气；葛根、丹参、川茸、当归、半夏、桂枝、白芍为臣药，辅助君药并能活血祛瘀，化痰散结；柴胡、甘草为佐使，攻补兼施，升降协调，宣通内外。

现代药理证实，柴胡、甘草、川茸、枸杞子、半夏等，可通过清除自由基、促进抗氧化酶合成与活化、提高抗氧化酶活性等作用；葛根、黄黃、丹参等，可通过改善内耳微循环障碍、抑制耳蜗毛细胞凋亡等作用网。

本研究结果显示，补肾益聪汤能持续降低血糖、降低ABR阈值、提升SOD活性，提高Trx基因表达水平，药效稳健持久，提示补肾益聪汤治疗T2DM耳聋的机制之一可能是通过持续改善T2DM耳聋的高糖状态以及提升机体抗氧化能力，减少耳蜗毛细胞氧化损伤，提高耳蜗中Trx基因表达水平，改善听力，以达到治疗T2DM耳聋的目的。

参考文献：
[1]黄国威，李国庆,严晓菊，等.糖尿病性耳聋听力变化特点[J].中华耳科学杂志,2016,14(6):813-818.
[2]罗诚，戴爱国,蒋永亮.硫氧还蛋白-1与衰老的研究进展[J].临床与病理杂志,2016,36(4):492-495.
-10-Clinical Journal of Chinese Medicine2021Vol.(13)No.4
⑶张倩，梁晓春.氧化应激与糖尿病周围神经病变的研究进展［J］冲华内分泌代谢杂志,2015,31(11):1000-1003.
［4］尹彦波，袁雅生,迟放鲁.隐性挺力下降小鼠耳蜗内毛细胞突触的病理改变［J］.复旦学报:医学版,2017,44(2):175-180.
［5］黄国威，吕萍，于宁.糖尿病性听力损失的特点及发生机制［J］.听力学及言语疾病杂志,2016,24⑹:624・627.
［6］唐年亚，张岳.生地、丹参对2型糖尿病大鼠腹主动脉中膜超微结构的影响卩］冲医临床研究,2015,7(5):30-31.［7］唐年亚，张岳.“脏虚络痹”识消渴［JJ.中医临床研究,2015,7(1):64-65.
基金项目：
2017年度河南省高等学校青年骨干教师培养计划(2017GGJS290)；2018年南阳市科技攻关项目(KJGG2018098)；2020年南阳市科技攻关项目(KJGG112)。

编辑：弓良彦编号：EA-4200622219(修回：2021-02-02)
益元清肺法治疗慢?I生阻塞4生月市疾病急生加重期临床观案Clinical observation on treating acute exacerbation of
chronic obstructive pulmonary disease by the Yiyuan Qingfei therapy
耿继飞
(泰妥市中医医院，山东泰妥，271000)
中图分类号：R259文献标识码：A文章编号：1674-7860(2021)04-0010-03证型：GD
【摘要】目的：观察益元清肺汤对慢性阻塞性肺疾病急性加重期(Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonaty Disease, AECOPD)的患者炎性指标、肺功能及临床疗效的彩响。

方法：随机选取泰妥市中医医院AECOPD上盛下虚型的患者107例，分为观察组(54例)和对照组(53例)，两组患者均给予西医基础治疗(化痰平喘、吸氧和抗感染等)，观察组在西医基础治疗上应用益元清肺汤，早晚口服，每次200mL,连用14d,观察两组患者的血清炎性指标(血白细胞计数、超敏C反应蛋白、降钙素原)、肺功能[1秒用力呼气肺容积(Forced ExpirakMyWlume in One Second,FEVi)、1秒用力呼气量/用力肺活量(Forced Vital C^acity,FVC)、1秒用力呼气量/预计值(FEVi%)],并同时观察两组患者治疗后7d,14d的氧分压(PQ)、二車化碳分压(PCCh)水平和患者的临床疗效。

结论：AECOPD上盛下虚型患者在西医基础治疗上加用益元清肺汤可降低患者的炎性指标，改善肺功能，提高氧分压，改善患者临床症状，提高临床疗效。

【关键词】益元清肺汤；慢阻肺急性加重期；炎性指标；肺功能；临床疗效
[Abstract]Objective:To observe the effect of the Yiyuan Qingfei decoction(益元清肺汤)on the inflammatory index,lung function and acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease.107patients with deficiency in acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease were divided into the observation group(54cases)and control group(53cases).Conclusion:In the acute exacerbation stage of chronic obstructive pulmonary disease,the addition of the Yiyuan Qingfei decoction to the basic treatment of western medicine can reduce the patient's inflammatory indicators,improve lung function,increase oxygen partial pressure,improve clinical symptoms,and improve health clinical efficacy.
[Keywords]The"yuan Qingfei decoction;Acute exacerbation of COPD;Inflammatory indicators;Pulmonary function;Clinical efficacy doi:10.3969/j.issn,1674-7860.2021.04.003
慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)是一种以不完全可逆的气流受限为特征慢性肺部疾病，其气流受限程度呈进行性发展，是呼吸系统常见病、多发病，主要与肺部异常的炎症反应有关。

COPD主要使肺脏受累，但也可以引起肺外的其他不良效应U其主要病理变化为粒细胞浸润，引起的气道炎性反应，导致气道重塑、气流受限、肺组织损伤何。

AECOPD是指患者在疾病过程中短期内出现咳嗽、咯痰、喘息等症状加重，痰量突然增多，呈黏液脓性或脓性，可伴发热等症状眄进一步加速肺功能的损害，引起一系列严重的并发症，甚至危及生命。

目前临床上的治疗方案及药物选择多种多样(包括抗生素的应用)，尽管这些治疗方案及药物可暂时缓解患者咳嗽、咯痰、喘息等症状，但对肺功能并不能改善叫同时抗生素引起的细菌耐药性及二重感染严重阻碍了疾病的预后。

近年来中医中药治疗AECOPD越来越受重视，由于中药复方制剂的多途径、多靶点的作用特征，使得中医药在防治AECOPD方面具有独特的优势。

我们应用益元清肺汤联合常规西药治疗可以明显降低炎性因子水平，改善肺功能，提高氧分压，改善患者的预后，临床疗效较好，现报道如下。

1资料与方法
1.1一般资料
选取2019年1月一2020年1月泰安市中医医院住院治疗的AECOPD上盛下虚型患者107例，均符合《慢性阻塞性肺疾病的诊治指南(2013年修订版)》冋，排除其他重大。