米根霉以木糖为碳源发酵产L_乳酸的动力学

农产品加工·学刊
2009年第10期
收稿日期：2009-07-21
基金项目：国家高技术研究发展计划项目（2007AA10Z361）；安徽省农产品精深加工重点实验室项目（2009AKSY0102）。

作者简介：吴学凤（1981-），女，山东人，在读博士，研究方向：农产品生物技术。

E-mail ：applewuxf@ 。

*为通讯作者：姜绍通，教授，研究方向：农产品加工与利用。

E-mail ：jiangshaotong@ 。

0引言
乳酸作为一种古老而重要的有机酸，自1780年首次被发现至今，已广泛应用于食品、医药、农业和化工等方面[1]。

当前，L-乳酸也可以作为原料大规模地应用于可生物降解塑料、氧化化学品、绿色化学品和溶剂，以及植物生长调节剂等方面。

所以，对L-乳酸的研究和生产已引起了国内外的重视。

在农产物料中，利用米根霉直接发酵生产L-乳酸已经有了较广泛的研究，近年来一些研究者利用根霉对酶解处理或者未处理的玉米芯、玉米秸秆、淀粉等发酵，取得了一定的结果[1~10]，但是发酵生产L-乳酸的得率很低，其中关键的原因是一些农产品的酶解产物中不仅含有葡萄糖，还含有木糖等多种寡糖。

解决米根霉利用纤维素水解液发酵产L-乳酸强度的关键，是如何提高米根霉利用木糖发酵产L-乳酸的生产强度问题。

本文对不同浓度木糖对米根霉发酵产L-乳酸的影响进行了研究，并对米根霉利用木糖发酵生产L-乳酸的动力学过程进行了研究，建立了动
力学模型，从而为提高米根霉利用五六碳糖共发酵生产L-乳酸的发酵效率提供研究基础。

1
材料与方法
1.1菌种
米根霉As3.819，合肥工业大学生物与食品工程学院发酵实验室保藏菌种，保存在PDA 培养基上，每60d 转移1次斜面；孢子，由PDA 培养基产生，用无菌蒸馏水洗下孢子，制成悬液。

1.2培养基
1.2.1固体斜面培养基
PDA 培养基（马铃薯葡萄糖培养基）。

1.2.2发酵培养基
葡萄糖120g/L ，(NH 4)2SO 44g/L ，NaH 2PO 40.140g/L ，KH 2PO 40.160g/L MgSO 4·7H 2O 0.25g/L ，ZnSO 4·7H 2O 0.22g/L ，CaCO 360g/L 。

1.3培养方法
1.3.1摇瓶培养方法
在pH 自然值条件下，每个250mL 的三角瓶装
米根霉以木糖为碳源发酵产L-乳酸的动力学
吴学凤，*姜绍通，王丽娟，操丽丽，陈小举，刘
模，庞锐
（合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009）
摘要：研究不同浓度木糖对米根霉发酵生产L-乳酸的影响；建立木糖为碳源的米根霉发酵产L-乳酸的动力学模型，
并进行验证。

结果显示，木糖质量浓度为100g/L ，米根霉在发酵72h 时，L-乳酸产量达到最高为51.67g/L ；发酵周期延长至144h ，发酵132h ，乳酸产量最高为71.55g/L 。

应用M atlab 软件对发酵动力学方程关键参数进行求解，建立动力学模型，所建模型与实验数据能较好地吻合（R 2≥0.98）。

关键词：木糖；米根霉；L-乳酸；动力学中图分类号：Q814.9文献标志码：A doi ：10·39691jissn ·1671-9646（X ）·2009·10·
011Kinetics of Production of L-lactic Acid by Rhizopus Oryzae Using Xylose
Wu Xuefeng ，*Jiang Shaotong ，Wang Lijuan ，Cao Lili ，Chen Xiaoju ，Liu M o ，Pang Rui
（School of Biotechnology and Food Engineering ，Hefei University of Technology ，Hefei ，Anhui 230009，China ）
Abstract ：The effects of xylose concentration on the production of L-lactic acid in the fermentation by Rhizopus oryzae were studied.Kinetic modeling of L-lactic acid production of Rhizopus oryzae using xylose was also studied.The results showed that with xylose 100g/L ，the concentration of L-lactic acid was the highest 51.67g/L cultured for 72h.With a longer delayed period 144h ，in 132h achieved the highest concentration of L-lactic acid 71.55g/L.The kinetics model was set up using M atlab software ；this model match better to the experimental data in the process of fermentation （R 2≥0.98）.Key words ：xylose ；Rhizopus oryzae ；L-lactic acid ；kinetics
第10期(总第187期)农产品加工·学刊
No.102009年10月
Academic Periodical of Farm Products Processing
Oct.
文章编号：1671-9646(2009)10-0044-04
2009年第10期
50mL 发酵液，115℃灭菌15min ，并接种2mL 孢
子悬液的菌落浓度为1×107cfu/mL ，摇床转速200r/min ，32℃恒温培养。

1.3.2发酵罐培养方法
3L 发酵罐装液量2.5L ，接种孢子悬浮液100mL （菌落浓度1×107cfu/mL ），温度控制为32℃，
搅拌转速400r/min ，通气量1.6L/(L ·
min)，发酵60h 。

1.4检测方法1.4.1样品处理
取50mL 发酵液用滤纸过滤，滤液用作检测乳酸及木糖质量浓度，过滤菌体用以测定生物量。

每个发酵试验做3个平行，结果取平均值。

1.4.2乳酸的测定
EDTA 定钙法[11]。

1.4.3木糖的测定
3，5-二硝基水杨酸法（DNS 法）[12]。

1.4.4生物量的测定
菌体干质量法[12]。

2
结果与分析
2.1木糖浓度对米根霉发酵产L-乳酸的影响
在pH 自然值条件下，以木糖为唯一碳源，发酵72h 后取样，测定L-乳酸产量及生物量。

木糖质量浓度对米根霉发酵产L-乳酸的影响见图1。

图1表明，在米根霉利用木糖发酵产L-乳酸的
过程中，L-乳酸产量及生物量随木糖质量浓度的增加而先增加后降低。

木糖质量浓度为20~100g/L 时，发酵L-乳酸产量及生物量随木糖浓度的增加而增加；木糖质量浓度为100g/L 时，L-乳酸产量最高；木糖质量浓度为51.67g/L 时，生物量较大，为2.4641g/L ；当木糖浓度超过100g/L 时，发酵L-乳酸产量及生物量随木糖浓度的增加而降低，可能是因为高浓度的木糖抑制了菌体生长，从而使L-乳酸产量下降。

由此分析可知，高浓度木糖对米根霉生长有抑制作用，这与葡萄糖为碳源发酵产L-乳酸相类似[13]。

米根霉在利用碳源发酵产L-乳酸的过程中，适当浓度的葡萄糖或木糖能够促进L-乳酸的生产，但是
高浓度的葡萄糖或木糖反而会抑制L-乳酸的合成。

2.2米根霉利用木糖发酵的过程曲线
在pH 自然值条件下，以木糖最佳发酵浓度配制培养基，发酵144h ，每隔12h 取样测定L-乳酸产量、生物量及残糖。

米根霉利用木糖发酵产L-乳酸的过程曲线见图2。

图2表明，当以木糖（质量浓度为100g/L ）为
碳源时，发酵前24h 的L-乳酸产量很低，为产物形成延滞阶段；在24~120h ，随发酵时间的延长，生物量逐步提高，此过程中L-乳酸的产量随生物量的提高而同步提高，说明L-乳酸生产过程与菌体生长部分偶联；发酵120~132h 期间，L-乳酸产量趋于稳定；发酵132h 时L-乳酸产量达到最大，为71.55g/L ，此时生物量也最高，为4.7236g/L ；发酵至144h 生物量下降，部分菌体可能衰亡，此时L-乳酸的产量也下降，分析原因可能是在木糖消耗尽的同时，米根霉利用了L-乳酸。

由图2分析得出，米根霉利用木糖的速度较慢，米根霉利用葡萄糖发酵生产L-乳酸时，葡萄糖为120g/L 发酵60h 即能达到发酵终点，且乳酸生产率最高可达90%[13]，相对而言利用木糖发酵产L-乳酸时，发酵周期延长至144h ，乳酸最高产率仅为71.55%，由此分析可知，提高米根霉菌体生长速率是提高乳酸产率的关键途径。

2.3米根霉发酵产L-乳酸的动力学初步研究2.3.1动力学模型的选取
（1
）菌体生长动力学模型的选取。

因为Monod 模型主要用来描述单一底物限制情形下的细胞生长，而这种理想情况是极少的。

从发酵过程代谢曲线来看，菌体浓度增加对菌体生长的影响不能忽略，这样M onod 就不宜用于L-乳酸发酵过程中描述菌体生长动力学模型。

Logistic 方程是一个典型的S 型曲线，能较好地反映发酵过程中因菌体浓度的增加对自身生长的抑制作用，用于拟合发酵过程中菌体的生长规律。

因此，选用Logistic 方程作为米根霉菌体细胞生长动力学模型：
d X d t =μm ax (1-X X m ax
)X .（1）图2米根霉利用木糖发酵产L-乳酸的过程曲线
图1木糖质量浓度对米根霉发酵产L-乳酸的影响
6050403020100L -乳酸质量浓度/g ·
L -120
40
60
80100120140
160
◆
◆◆
◆
◆
◆
木糖质量浓度/g ·
L -1◆3.5
3.0
2.5
2.0
1.51.00.50.0
生物量/g ·
L -1◆-乳酸质量浓度；-生物量
■■
◆■
■
■
■
■
■
■
10080604020
00
2448
7291130144◆发酵时间t /h
54
32
1
■
▲▲
▲▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲
▲▲■
■
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■
■◆
◆
◆
◆
◆
◆◆
◆
◆◆
◆
◆-乳酸质量浓度；-残糖质量浓度；-生物量
■▲L -乳酸、残糖质量浓度/g ·
L -1生物量/g ·L -1吴学凤，等：米根霉以木糖为碳源发酵产L-乳酸的动力学·45·
农产品加工·学刊2009年第10期式中：μm ax——
—最大比生长速率，h-1；
X m ax——
—可得到的最大菌体质量浓度，g/L。

（2）产物生成动力学模型的选取。

通过代谢过程
曲线分析，在该实验条件下，米根霉发酵过程中，
L-乳酸合成属于部分生长偶联型，因此乳酸生成动
力学模型可以用Luedeking-Piret方程来描述。

d P d =αd X
d
+βX.（2）
式中：α——
—与菌体生长相偶联的产物生成常数；
β——
—与菌体量相关联的产物生成常数。

（3）底物消耗动力学模型的选取。

在L-乳酸发酵过程中，底物的消耗主要用于3个方面：①米根霉细胞生长，新细胞的合成；②维持米根霉细胞代谢活动；③生成产物L-乳酸。

由于用于产生能量维持细胞代谢活动所消耗的底物很少，为建模简化起见，可以将其忽略，即乳酸发酵过程中底物的消耗主要分为细胞生长和产物生成两部分。

根据实验结果分析，产物生成与细胞生长部分偶联，常采用Luedeking-Piret 方程来描述底物消耗情况，其动力学模型如下：
d S d t =-d X
d t
×1
Y X/S
-d P
d t
×1
Y P/S
.（3）
式中：Y X/S——
—碳源用于菌体生长的得率常数；
Y P/S——
—碳源用于产物积累的得率常数。

其中令p=1
Y X/S ，q=1
Y P/S
，得到如下方程：
d S d t =-(p+αq)d X
d t
-qβX.（4）
2.3.2木糖为碳源的米根霉发酵产L-乳酸的动力学模型
（1）米根霉细胞生长动力学模型。

用M atlab软件对米根霉细胞生长的实验数据进行非线性拟合，并结合逻辑公式可得：
μm=0.0378h-1（X m=5.1752），
因此，米根霉利用木糖的细胞生长动力学模型方程为：
d X d = 3.4132e-0.0378t (1+17.4482-0.0378)2
.
（2）L-乳酸产生动力学模型。

由于P0为L-乳酸的起始含量，所以P0=0，结合数据作图，可得直线斜率：
α=20.6894（β=-0.0648）
将实验数据代入式（2），可得摇瓶第2批次L-乳酸产生的动力学模型方程：
d P d =70.6171e-0.0378t
(1+17.4482)
-0.3354
1+17.4482
.
（3）底物消耗动力学模型。

用M atlab软件对实验数据进行非线性拟合，得到数据：
p=4.5595，q=1.0872
代入式（4）可得底物消耗的动力学模型方程：
d S
d t
=-92.34e-0.0378t
(1+17.4482e-0.0378t)2
+0.3646
1+17.4482e-0.0378t
.
（4）模型的验证。

利用所求得模型参数拟合曲线，与实验数据分布趋势进行比较，米根霉利用木糖发酵产L-乳酸的R2均大于0.98，所建模型与米根霉细胞生长及产物生成过程中的实验数据能较好地吻合，因此可以作为米根霉发酵产L-乳酸优化控制的参考依据。

动力学模型的验证见图3。

3结论
（1）对以木糖为碳源对米根霉发酵产L-乳酸的影响进行了研究。

在不同浓度木糖对米根霉发酵产L-乳酸影响的基础上，进行米根霉以木糖为碳源发酵产L-乳酸的动力学研究。

（2）木糖为唯一碳源的最佳质量浓度为100g/L，
图3动力学模型的验证
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆◆5
4
3
2
1
024487296120144
（a）R2=0.9902
发酵时间t/h
生
物
量
/
g
·
L
-
1
◆
◆
◆
◆
◆
◆◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
80
60
40
20
024487296120144
（b）R2=0.9897
发酵时间t/h
L
-
乳
酸
质
量
浓
度
/
g
·
L
-
1
◆
◆◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆
◆◆100
80
60
40
20
024487296120144
（c）R2=0.9964
发酵时间t/h
残
糖
质
量
浓
度
/
g
·
L
-
1
·46·
2009年第10期
[1]
说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面法适用于对醋糟厌氧发酵制氢工艺进行回归分析和参数优化。

3
结论
（1）利用试验设计软件Design Expert ，采用
Central Composite Design 建立了F/M 、固液比、初始pH 值和发酵温度与产氢量之间的二次多项数学模型：
Y =26.63+1.34x 1+1.27x 2-6.74x 3-2.44x 32-6x 42-1.7x 2x 3-2.35x 3x 4.
回归分析表明，该模型能解释91.60%响应值的变化；通过模型系数显著性检验，得到因素的主效应关系为：初始pH 值>F/M>固液比>发酵温度。

（2）利用模型的响应面对产氢量影响的关键因子及其相互作用进行探讨，优化出醋糟厌氧发酵制氢的最佳条件为：F/M 1.65，固液比16.9g/200mL ，初始pH 值6.02，发酵温度37.66℃，产氢量理论值为32.91mL/g TS ，验证值为33.73mL/g TS ，理论值与验证值的复相关系数为0.9780。

证明此模型是合理可靠的，可用于实际预测。

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[2][3][4][5][6][7][8][9][10]（上接第43页）
L-乳酸产量为51.67g/L ，当发酵时间延长至144h ，
乳酸产量为71.55g/L 。

（3）运用M atlab 软件对动力学方程关键参数求解，μm =0.0378h -1，X m =5.1752，α=20.6894，β=-0.0648，p =4.5595，q =1.0872。

比较建立的动力学模型与实验数据的分布趋势，R 2均大于0.98，说明该动力学方程可以作为米根霉发酵产L-乳酸优化控制的参考依据。

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