特异性阻断Kv1.5通道对心房颤动患者缝隙连接蛋白40表达的影响

特异性阻断Kv1.5通道对心房颤动患者缝隙连接蛋白40表
达的影响
张珂;石开虎;徐盛松;曹炜;宣海洋;沙纪名
【摘要】Objective To evaluate the expression of atrial muscle gap junction Cx40 in rheumatic heart disease with chronic atrial fibrillation by using the new class M antiarrhythmic drug ibutilide specific block ultra-rapid delayed rectifier potassium channels( Kvl. 5 ), to discuss possibility of the Kvl. 5 potassium channels to be one of downstream signal transduction pathways of the atrial muscle gap junction protein, and to reveal the possible mechanism of atrial fibrillation( AF ). Methods The experiment specimens were taken from right atrial appendage tissues of rheumatic heart disease patients who accepted the valve replacement surgeries, and these specimens were divided into 2 groups according to the heart rate before surgeries. The sinus rhythm group of rheumatic heart disease
[ sinus rhythm ( SR ) group ], and the atrial fibrillation group of rheumatic heart disease heart disease( AF group ). Enzyme was used to dissociate atrial myocytes, atrial myocytes was cultured and Western blot was used to detect the protein expressions of Cx40 in two groups before and after they were selective acted on by the selective Kvl. 5 potassium channel blocker-ibutilide. Results After using the Class M antiarrhythmic agents to selective act on Kvl. 5 potassium channel in rheumatic heart disease with chronic atrial fibrillation, the expression of Cx40 was significantly higher in AF group ( P <0. 01 ). The protein expression of Kvl. 5 was not significantly
changed in SR group. Conclusion In the group of rheumatic heart disease with atrial fibrillation, the expression of Cx40 was significantly increased after using the specific inhibitor of Kvl. 5 potassium channel blocker in AF group, proving that the open Kvl. 5 potassium channels may affect the expression of connexin Cx40, which further reveals that electrical remodeling may lead to the diversification of structural remodeling in AF.%目的利用伊布利特特异性阻断超速延迟整流性钾通道 (Kv1.5)后对缝隙连接蛋白(Cx)40表达的影响,探讨Kv1.5通道可能是心房肌缝隙连接蛋白下游信号传导通路之一,揭示心房颤动(AF)的可能发生机制.方法实验标本取自风湿性心脏病接受心脏瓣膜置换手术患者的右心耳组织,根据患者术前心律将标本分为2组:风湿性心脏病[窦性心律组(SR组)]和风湿性心脏病合并AF组(AF组).采用酶解法分离风湿性心脏病接受手术患者心房肌细胞、培养心房肌细胞和运用Western blot技术检测两组心房肌细胞运用伊布利特特异性阻断Kv1.5通道前后Cx40的表达情况.结果利用伊布利特特异性阻断Kv1.5通道后,AF组患者心房心肌细胞Cx40的表达水平较阻断前明显增加(P<0.01);而在SR组中,阻断前后Cx40/GAPDH比值的变化不明显.
结论 Kv1.5通道的开放状态可能会影响Cx40的表达,从而揭示AF的发生机制中电重构可能会引起结构重构.
【期刊名称】《安徽医科大学学报》
【年(卷),期】2013(048)003
【总页数】4页(P283-286)
【关键词】Kv1.5钾通道阻滞剂;心房颤动;缝隙连接蛋白
【作者】张珂;石开虎;徐盛松;曹炜;宣海洋;沙纪名
【作者单位】安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥,230601;安徽医科大学第
二附属医院心胸外科,合肥,230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合
肥,230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合肥,230601;安徽医科大学第二
附属医院心胸外科,合肥,230601;安徽医科大学第二附属医院心胸外科,合
肥,230601
【正文语种】中文
【中图分类】R972.2;R541.75;R341.7
心房颤动(atrial fibrillation，AF)是临床上最常见的一种心律失常疾病，可发生在
任何年龄的人群中，发病率高达0.4% ～1%，少数儿童时期发病，85岁以上的老年人群患病率高达20%［1］。

AF可诱发充血性心力衰竭，并增加血管栓塞性脑
卒中的危险性和死亡率。

目前药物治疗AF的方法很局限，且安全系数小，可导致一些严重的心律失常，例如多非利特、胺碘酮等。

AF的发生机制尚无定论，如郭
志祥等［2］提出炎症反应可能是AF发生和维持的因素之一。

但目前公认AF的
发生机制之一的心房电重构可作为一个研究方向:超速延迟整流钾通道(Kv1.5通道)仅表达于心房，其对应电流为超速延迟整流钾通道电流(Ikur)，离子通道的分子基
础是Kv1.5钾通道，在心房复极中起重要作用，在AF患者中，该通道会大量开放。

笔者目前研究的方向阻断该通道是否会影响心房结构重构，这对AF的早期治疗和转归起一定的作用。

该研究利用伊布利特的特异性选择Kv1.5通道的特点，阻断
Kv1.5钾通道后，检测对缝隙连接蛋白(connexin，Cx)40表达的影响。

1 材料与方法
1.1 标本来源实验标本取自风湿性心脏病接受心脏瓣膜置换手术患者的右心耳组织，开胸后，建立体外循环前切取标本后立即放心肌转运液中。

根据患者术前心律
将标本分为2组:风湿性心脏病合并AF组(AF组，AF持续6个月以上)8例，男4例，女4例，平均年龄(52.13±14.07)岁、左房内径(6.46±1.02)cm、左室射血分数(LVEF)值(0.59±0.06);风湿性心脏病［窦性心律(sinus rhythm，SR)组，无阵发性房扑及 AF病史)］8例，男3例，女5例，平均年龄(55.00±9.62)岁、左房内径(6.35±0.46)cm、LVEF值(0.56±0.09)。

术前两组在年龄、左房内径、LVEF值及心功能分级比较差异无统计学意义。

本研究经过安徽医科大学伦理委员会审议通过。

1.2 主要试剂与药物胶原酶Ⅰ型、蛋白酶XXⅣ型、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES 液购自Sigma公司;心肌转运液、GAPDH羊多克隆抗体购于上海康成生物工程有限公司;组织裂解液(中度)购于碧云天公司;Kv1.5羊多克隆抗体购于Santa Cruz公司;羊抗兔IgG购于北京中山公司;富马酸伊布利特(10 ml∶1 mg)购于马鞍山丰原制药有限公司。

1.3 主要仪器 KADAKID型凝胶成像分析系统(美国KODAK公司)。

1.4 方法
1.4.1 标本收取体外循环手术插管前取右心耳组织，用100%纯氧预充的冰冷的心肌转运液保存并10 min内送回实验室，用于心肌细胞分离实验。

1.4.2 心房肌细胞的分离与培养分离方法参照Bustamante et al［3］使用的方法并加以改进，将心脏外科手术体外循环转机前，剪下荷包线缝合范围内的右心耳心肌组织置于心肌转运液中，立即送至实验室进行细胞分离。

细胞分离:第一步，将标本用无钙台液洗涤，洗涤过程中将血液和油脂洗净，小心剔除心外膜上的脂肪和结缔组织，再将心肌标本剪成1 mm3大小的组织块，接着将组织块在用无钙台液冲洗3遍，每次5 min;第二步，先将上述组织块在加入盛有10 ml消化液Ⅰ(胶原酶Ⅰ2 mg+蛋白酶XXⅣ1.6 mg+BSA 4 mg+无钙台液4 ml)的离心管中，放入36.5℃水浴箱中消化45 min，再转入盛有10 ml消化液Ⅱ(胶原酶Ⅰ2 mg+BSA
4 mg+无钙台液4 ml)的离心管中，放入36.5℃水浴箱消化约50 min，消化过程中每隔10 min做1次镜检。

当镜检视野中出现大量的带有横纹、细胞膜表面无明显起泡的杆状细胞时，即可加入等量的含20%胎牛血清的培养液终止消化;第三步，将消化液经200目的钢筛滤去未消化的组织，1 000 r/min离心
5 min，弃上清，将细胞贮存在无钙台液中;未消化的组织重复置于消化液Ⅱ中再消化30 min，用相似的方法收集细胞。

最后用KB液于4℃保存备用。

以上操作均恒温水浴维持在37℃，持续充以100%氧气下操作。

1.4.3 细胞培养与药物干预将制备的细胞分别加入含20%胎牛血清的DMEM培养基和含伊布利特浓度为10－7mol/L的20%胎牛血清的DMEM培养基中;吹打成
细胞悬液，调整细胞密度为4×108个/L接种在25 cm2的聚苯乙烯培养瓶，置于37℃，体积分数为5%的CO2培养箱中，6 h后第一次换培养基，随后每24 h换液1次，培养48 h。

1.4.4 Western blot法检测 Kv1.5 通道蛋白表达①将样品用1×PBS洗净后加入组织裂解液，置于冰上30 min，4℃、10 000 r/min 离心 10 min，取上清液;②利
用考马斯亮蓝染液方法测定蛋白质浓度;③ 各样品上样量为25 μl，含20 μg总蛋
白质，加入样品缓冲液，沸水浴5 min;④ 进行SDS-PAGE分离后采用半干转印技术进行转印;⑤质量分数为5%脱脂牛奶封闭，室温振荡孵育2 h，分别加第一抗体(Kv1.5为1∶500、GAPDH 为1∶500)过夜，用PBST洗膜后加入二抗(羊抗兔IgG，1∶5 000)，室温振荡孵育1 h;⑥用PBST洗膜后，进行DAB增强显色法显色，凝胶成像系统扫描;⑦ 采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析，以Cx40和GAPDH灰度值的比值反映目的蛋白的表达水平。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料均以±s表示，组间比较采用配对设计资料t检验。

2 结果
2.1 心肌细胞培养结果显微镜下培养48 h的心肌细胞呈带有横纹、细胞膜表面无明显起泡的杆状细胞，细胞完整，呈棒杆状，长∶宽为4～6∶1，搏动频率约
150次/分，见图1。

图1 显微镜下心肌细胞培养48 h后形态学结构×40
2.2 Western blot检测 Cx40和 GAPDH 结果在40 ku(Cx40)和37 ku(GAPDH)
处分别出现蛋白表达的条带。

AF组患者心房心肌细胞Cx40的表达水平较阻断前
明显增加(P＜0.01);在SR组中，阻断前后Cx40表达水平无明显变化，见表1、图2。

图2 伊布利特阻断各组前后心肌细胞中Cx40的表达情况1:阻断前SR组;2:阻断前AF组;3:阻断后SR组;4:阻断后AF组
表1 伊布利特特异性阻断Kv1.5通道对Cx40表达的影响(n=8，±s)与AF组阻断前比较:＊＊P＜0.01Cx40/GAPDH比值1.55 ±0.29 1.61 ±0.13 0.53 ±0.14 1.29 ±0.17＊＊
3 讨论
目前治疗AF主要有频率控制策略和节律控制策略［4］，美国食品药物管理局批
准用治疗AF的药物是广谱的钾离子通道阻断剂决奈达龙，其在临床上有一些副作用。

本研究基于该现状，初步探讨利用选择性钾离子通道阻滞剂来转复窦性心律。

有研究［5］显示:阵发性AF患者心肌细胞上的Kv1.5通道的蛋白表达减少。

邓玉莲等［6］发现:持续AF患者Kv1.5通道mRNA水平较对照组有显著降低，在阵发性AF组不明显。

可见Kv1.5通道转录水平下降可能会导致Ikur减低，减少蛋
白的表达。

Petkova-Kirova et al［7］发现:Kv1.5、Kv4.2 及 Kv4.3等蛋白表达水平均降低。

这都证实了Kv1.5通道的变化与AF的发生有着密不可分的关系。

Kv1.5通道的转录水平是相应Ikur改变的分子基础，是AF发生电重构的关键环节。

所以本研究选择Kv1.5通道作为电重构的代表。

并且本研究结果表明:未进行药物
阻断的AF组Cx40的表达较SR组减低，与上述结果一致，为后面的药物阻断实
验提供了可靠的基础。

伊布利特是一种新型Ⅲ类抗心律失常药物，对离子通道的作用有其独特的特点。

有研究［8］表明:窦房结细胞的延迟整流钾电流分缓慢型(Iks)和快速型(Ikr)组成，
K+外流是心肌细胞复极的主要离子流，Ca+、Na+内流和K+外流的相对速率决
定2相平台期的长短，伊布利特对Ikr通道的抑制作用明显，而对Iks作用较弱。

伊布利特可以通过抑制复极的外向K+电流，同时延长动作电位时程和QTc间期［9－11］。

Wettwer et al［12］研究表明:AF 时尽管 Ikur的表达减低，但Ikur 在心房复极中的作用比在窦性心律时大得多。

同时伊布利特对心房肌的作用比心室肌更加明显［11，13－14］，Bashin et al［15］同样证实该药对房性心律失常
的作用效果要比对室性心律失常要好，对转复新发生的AF有效率为30% ～70%，而且起效快。

在国外，其仍然是治疗心律失常药物最活跃的药物之一。

这都为本研究选择伊布利特进行阻断Ikur提供了线索和依据。

在本研究中，特异性阻断AF组Kv1.5通道后较阻断前Cx40表达明显增加，而在SR组中，阻断前后的Cx40则无明显变化，说明Kv1.5通道与Cx40有密切关系，并且是治疗AF的靶点之一，阻断Kv1.5通道对心肌细胞的结构具有一定的影响，为后期动物模型实验提供了可靠的依据。

本研究选用较为成熟的酶解法分离人心房肌细胞同时观察伊布利特直接作用于
Kv1.5通道，排除了其他杂质细胞及离子通道的影响。

利用目的蛋白的表达量与GAPDH的表达量的比值来反映心肌细胞蛋白表达的变化，同时设置了对照组，实验具有可比性和可靠性。

由于是在体外培养心肌细胞进行实验，尚不能完全证实特异性阻断Kv1.5通道在动物实验中及人体内的效果如何，仍需在动物模型的实验
中加以证实。

综上所述，在AF患者中，特异性阻断Kv1.5通道后，Cx40的表达较阻断前表达
明显增加，提示Kv1.5通道的开放状态会影响Cx40的表达，Kv1.5通道是影响心肌结构重构的靶点之一，揭示AF患者心房肌细胞的电重构可能会引起结构重构。

利用这一特点可能会给临床上研究新型的治疗AF药物一些帮助。

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