白细胞介素-13基因多态性与壮族儿童哮喘易感性及血清IgE、白细胞介素-13水平的关系

白细胞介素-13基因多态性与壮族儿童哮喘易感性及血清IgE、
白细胞介素-13水平的关系
郭瑜修;林娜;刘运广;冯尚克;李强;陈霞静
【摘要】Objective To investigate the relationship of gene polymorphism
of interleukin-13 ( IL-13 ) with incidence of asthma , serum IgE and IL-13 levels in children with Zhuang nationality .Methods A total 112 healthy children with Zhuang nationality ( control group) and 80 asthma children with Zhuang nationality(asthma group) were enrolled.Polymorphisms of IL-13 gene -1112C/T and +2044A/G loci,serum IgE and IL-13 levels were detected.Results (1) CC genotype and C allele of IL-13 -1112C/T locus were dominant in the asthma and control groups,but no significant difference in the distribution of genotype frequency or of allele frequency was found between the two groups (P>0.05).There was significant difference in the distribution of genotype frequency and allele frequency of IL-13 +2044A/G locus between the two groups(P<0.05),AG genotype and GG genotype were the common genotypes in the asthma group and control group respectively,and the A allele frequency in the asthma group was significantly higher than that in the control group(P<0.05).(2)In the asthma group and control group,there were no significant differences in the serum IgE or IL-13 level among different genotypes of IL-13 -1112C/T or
+2044A/G locus (P>0.05).In the three genotypes of IL-13 -1112C/T
locus,the serum IgE levels of the asthma group were higher than those of the control group(P<0.05),but there were no significant differences in the
serum IL-13 levels in the three genotypes of IL-13 -1112C/T locus between the two groups(P>0.05).In the three genotypes of IL-13 +2044A/G locus,the serum IgE and IL-13 levels of the asthma group were higher than those of the control group(P<0.05).Conclusion Polymorphism of IL-13
+2044A/G locus is associated with the incidence of asthma,may be related to the elevation of IL-13 and IgE levels,and is a susceptible gene of asthma in the children with Zhuang nationality .However,gene polymorphism of IL-13 -1112C/T locus is not associated with the incidence of asthma in children with Zhuang nationality .%目的探讨白细胞介素-13(IL-13)基因多态性与壮族儿童哮喘发病及血清IgE、IL-13水平的关系.方法选择112名健康壮族儿童(对照组)和80例壮族哮喘患儿(哮喘组),检测其IL-13基因-1112 C/T和+2044 A/G位点多态性以及血清IgE、IL-13水平.结果 (1)哮喘组和对照组IL-13-
1112C/T位点均以CC型为主,等位基因以C为主,两组间基因型、等位基因频率分布比较,差异均无统计学意义(P>0.05);两组IL-13+2044A/G位点基因型、等位基因频率分布比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中哮喘组以AG型最常见,对照组以GG型最多见,哮喘组A等位基因频率高于对照组(P<0.05).(2)哮喘组、对照组组内IL-13-1112C/T、+2044A/G位点不同基因型之间血清IgE、IL-13水平比较差异均无统计学意义(P>0.05),哮喘组IL-13-1112C/T位点3种基因型患者的血清IgE 水平均高于对照组(P<0.05),而两组间IL-13-1112C/T位点3种基因型患者的IL-13水平比较差异无统计学意义(P>0.05);哮喘组IL-13+2044 A/G位点不同基因型患者的血清IgE水平、IL-13水平均高于对照组(P<0.05).结论 IL-13+2044A/G位点多态性与壮族儿童哮喘发生有关,可能与血清IL-13、IgE水平升高有关,是广西壮族儿童哮喘哮喘发病的易感基因;但IL-13-1112C/T位点基因多态性与壮族儿童哮喘的发病无关联.
【期刊名称】《广西医学》
【年(卷),期】2017(039)009
【总页数】4页(P1288-1291)
【关键词】哮喘;白细胞介素-13;基因多态性;儿童;壮族;广西
【作者】郭瑜修;林娜;刘运广;冯尚克;李强;陈霞静
【作者单位】右江民族医学院附属医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属西南医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属西南医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属医院儿科,百色市 533000;右江民族医学院附属医院儿科,百色市 533000
【正文语种】中文
【中图分类】R256.12
论著·临床研究
支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见且复杂的多基因遗传病，是与T细胞介导的免疫紊乱有关、多种炎性细胞参与的一种呼吸道慢性炎症，血清IgE在其中起着重要的调控作用[1]。

白细胞介素(interleukin，IL)-13作为Th源性细胞因子，是除了IL-4外已知的能直接调控血清IgE的细胞因子，其基因位于5号染色体q31-32区[2]。

本研究分析IL-13基因-1112C/T和+2044A/G位点多态性与壮族儿童哮喘发病及其血清IgE、IL-13水平的关系，以遗传学角度探讨壮族儿童哮喘的发病机制。

1.1 临床资料选择2012年5月至2014年6月在右江民族医学院医附属医院、右
江民族医学院附属西南医院儿科就诊的急性发作期哮喘儿童80例为研究对象(哮
喘组)，男性56例，女性24例，年龄为1～13(5.4±1.8)岁。

均符合2008年《儿童支气管哮喘诊断和治疗指南》中的诊断标准[3]，患儿4周内未使用过糖皮质激素。

同期选择在门诊体检的健康儿童112例为对照组，男性72例，女性40例，年龄为3～14(6.3±2.1)岁，哮喘组居住地为城市32人，农村48人；对照组居住地为城市47例，农村65人。

本人及三代以内直系亲属中无哮喘、过敏史和其他
免疫性疾病，近2个月无急性呼吸道感染和未使用糖皮质激素。

两组儿童祖辈三
代以上均为世居广西的壮族人群，相互间无血缘关系。

两组年龄、性别、居住地等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

本研究经右江民族医学院
学术伦理委员会讨论通过，家长均签署知情同意书。

1.2 方法
1.2.1 标本采集：空腹采集静脉血3 ml，其中1 ml用EDTA-K2抗凝，用于提取
基因组DNA；另外2 ml缓慢注入干燥试管中，静置1 h后，3 000 r/min离心
10 min，抽吸上清液300 μl 至0.5 ml微量离心管中，-80℃冷冻保存待检IL-13
和IgE。

1.2.2 IL-13基因多态性分型：(1)用少量血液基因组DNA抽提试剂盒(东盛生物公司)提取DNA，紫外分光光度计检测DNA浓度，-20℃冻存待检。

(2)PCR检测：IL-13 -1112C/T和+2044A/G位点扩增引物参照文献[4]设计合成，-1112/T位点的上、下游引物序列分别为：5′-GGA ATC CAG CAT GCC TTG TGA GG-3′、5-GTC GCC TTT TCC TGC TCT TCC CGC-3′，+2044A/G位点的上、下游引物序
列分别为5-CTT CCG TGA GGA CTG AAT GAG ACG GTC-3、5-GCA AAT AAT GAT GCT TTC GAA GTT TCA GTG GA-3，均由北京三博志远生物公司合成。

DNA 扩增：20 μl反应体系中，模板DNA 1.5 μl(约50 ng)，双蒸水13.5 μl，
10×缓释液2 μl，2.5 mmol/L dNTPmix(天根生化科技公司)1.6 μl(200 μmol/L)，
20 μmol/L的引物上、下游各0.5 μl，Taq酶(天根生化科技公司)0.4 μl。

-
1112C/T位点采用94℃预变性5 min，94℃变性40 s，60℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环35次，72℃延伸5 min；+2044A/G位点采用94℃预变性5 min，94℃变性40 s，61℃退火40 s，72℃延伸40 s，循环35次，72℃延伸5 min；均利用美国BioRam公司的PC-200型扩增仪进行扩增反应。

(3)扩增产物的限制
性酶切：分别使用BstUI内切酶和NlaIV内切酶(Fermetas 公司)对IL-13 -
1112C/T和+2044A/G位点进行酶切反应。

① BstUI内切酶反应体系：PCR产物5 μl，BstUI内切酶0.4 μl，10×缓释液1 μl，牛血清白蛋白0.3 μl，加双蒸水达
15 μl混匀后置37℃恒温水浴3 h。

② NlaIV内切酶反应体系：PCR 产物5 μl，NlaIV内切酶0.25 μl，10×缓释液1 μl，加双蒸水达15 μl，混匀后置37℃恒温
水浴3 h。

(4)结果判定：电泳：以PCR Markers(东盛生物公司)作为DNA片段的相对分子量标记，于70 V、40 mA电流下将PCR酶切产物在8%聚丙烯酰胺凝胶中上样，在垂直电泳装置中电泳后放置溴化乙啶溶液中染色40 min，在凝胶成像系统下观察，根据电泳结果与DNA分子质量标记对比判定酶切分型结果。

1.2.3 血清总IgE、IL-13水平测定：采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法测定血清总IgE、IL-13，采用美国ADL公司ELISA试剂盒。

具体操作严格按说明书方法步骤进行。

1.3 统计学分析采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。

基因型及等位基因采用基
因计数法，对基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验；计数资料比较采用χ2检验或确切概率法；计量资料以(x±s)表示，比较采用t检验或方差分析，以P<为差异有统计学意义。

2.1 IL-13基因多态性检测结果 IL-13 -1112C/T位点经限制性酶切后有3种基因型，T等位基因纯合子出现大小分别为247 bp的条带，C等位基因纯合子出现大小分别为224 bp的条带，杂合子(CT)则出现大小分别为247 bp和224 bp的条
带，见图1。

IL-13的+2044A/G位点扩增片段距5′端26 bp处被限制性内切酶NlaIV识别酶切，用以控制酶切是否完全，若多态位点为G则距3′端32 bp处被
识别酶切，故GG基因型出现大小为178 bp的条带，AG基因型出现大小分别为210 bp和178 bp的条带，AA基因型只有大小为210 bp的条带，见图2。

2.2 两组IL-13基因多态性基因型频率和等位基因频率的分布比较在哮喘组与健康对照组中，IL-13 -1112C/T位点、+2044A/G位点的基因型期望值与观察值均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明两组样本达到遗传平衡，具有群体代表性。

哮喘组和对照组的IL-13 -1112C/T位点基因型均以CC型为主，等位基因以
C为主，两组基因型和等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

哮喘组IL-13 +2044A/G位点以杂合子AG最多见，对照组以GG型最多见，两组均以AA型最少见；两组基因型、等位基因频率分布比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其中哮喘组中A等位基因频率高于对照组(P<0.05)，见表2。

2.3 IL-13基因多态性对血清IgE、IL-13水平的影响在哮喘组、对照组组内，IL-13 -1112C/T、+2044A/G位点不同基因型患者的血清IgE、IL-13水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

哮喘组IL-13 -1112C/T位点3种不同基因型的血清IgE 水平均高于对照组(P<0.05)，但两组间IL-13 -1112 C/T位点不同基因型的
IL-13水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；哮喘组IL-13 +2044A/G位点不同基因型的血清IgE 水平、IL-13水平均高于对照组(P<0.05)。

见表3、表4。

哮喘是一种以气道慢性炎症和气道高反应性为主要特点的疾病，细胞因子对气道炎症的形成有着重要作用[5-7]。

有研究表明，IL-13在哮喘发病机制中可能起重要作用[8-9]。

IL-13是调节免疫反应的重要Th2类细胞因子，具有很多与IL-4相似的功能，IL-4参与特异性IgE的生成，而IL-13促进总IgE水平升高[10]。

IL-13基
因被认为是与哮喘发生相关的重要候选基因。

单核苷酸多态性是人类基因组DNA 序列中最常见的变异形式，对其进行研究是探讨基因与疾病关系的重要途径。

近年
来，遗传学研究结果表明IL-13基因启动子区域和编码区存在单核苷酸多态性位点，有学者对IL-13基因多态性进行了深入的研究，发现IL-13基因多态性可能与哮喘发病、血清IL-13异常、哮喘患者血清IgE水平有密切的相关性[4，11-12]。

IL-
13基因 -1112位点位于启动子区域，IL-13 -1112C→T突变与哮喘、气道高反应性、皮肤过敏试验结果及血清IgE水平密切相关[13]，而这可能与IL-13 -
1112C→T使该基因转录、表达增强有关。

编码区外显子4 +2044位点由A代替G，导致氨基酸Gln130Arg的改变，有利于IL-13与IL-13受体的结合，此变异
增加哮喘的发病[14]。

本研究结果显示，IL-13基因 -1112C/T和+2044A/G位点均存在3种基因型，哮喘组和对照组的IL-13 -1112C/T位点均以CC基因型和C等位基因最常见，但两组之间基因型、等位基因频率分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)，提示IL-13 -1112C/T位点多态性可能与广西壮族儿童哮喘发病无关联。

哮喘组和对照组的
IL-13 +2044A/G位点均以G等位基因最常见，但哮喘患者碱基由A代替G占48.8%，高于对照组(P<0.01)。

哮喘组以AG基因型常见(58.8%)，对照组以GG
基因型最常见(45.5%)，两组的基因型及等位基因频率分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示IL-13 +2044A/G突变可能与哮喘发病有关联，这与国内外部
分研究结果相似[15-18]。

有学者发现IL-13 -1112C/T基因多态性与白种人哮喘
发生有关，但与亚洲人群和非裔美国人哮喘发病无明显关系；而IL-13 +2044A/G 位点基因多态性与白种人和亚洲人群哮喘发病有明显相关性，却与非裔美国人哮喘发生不相关[19]。

近年来又有国外学者研究发现IL-13 +2044A/G位点基因多态
性与哮喘发病无明显关联[20-21]。

这些结果的不一致可能与基因多态性存在种族
差异性有关。

本研究结果还显示，两个位点相同基因型，哮喘组总血清IgE水平高于健康对照组，表明特应性与儿童哮喘发病关系密切。

哮喘组IL-13 +2044A/G位点不同基因型
频率之间血清IgE水平、IL-13水平均高于对照组(P<0.05)，提示IL-13
+2044A/G位点基因多态性与IL-13水平有关联，G→A突变[即导致编码的相应蛋白质的多态链第130位氨基酸由精氨酸转变为谷氨酰胺]使IL-13 mRNA表达增多，促进IL-13的合成分泌，使血清IL-13水平升高。

综述所述，IL-13基因+2044A/G位点多态性可能与壮族儿童哮喘发生、血清IL-13水平有关，而IL-13基因-1112位点多态性与广西壮族儿童哮喘发生无相关。

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