感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和提取流程.

感受态细胞的制备过程
— LB 液体培养基:胰蛋白胨, 1%(W/V ;酵母提取物, 0.5%(W/V ; NaCl ,
1%(W/V ,用固体 NaOH 调节 pH 为 7.0~7.2,分装于三角瓶中,灭菌后存于室温。

摇动三角瓶,如果发现变浑浊,表明已染菌,应弃掉重新配制; — 0.1 mol/L CaCl2:称取 1.47 g CaCl2•2H 20(Amresco 分装溶于 100 mL去离子水中,灭菌后存于 4℃;
—离心管(50 mL或 80 mL或 100 mL ,灭菌;
—培养试管,灭菌;
— 1 mL枪头,灭菌;
— 1 mL加样枪;
—滤纸,用牛皮纸包好后灭菌;
— 10 mL量筒,灭菌;
— 5 mL移液管,用棉花塞入管口,卷于报纸中灭菌;
—冰,离心管架;
—恒温摇床,可见分光光度计,玻璃比色杯。

1.接种空白大肠杆菌于 3 mL LB培养基中, 37℃剧烈震荡培养过夜;
2.将已培养好的种子液转入 100 mL LB培养基中扩大培养至 OD 650=0.3后,将培养好的细菌置于冰上冷却 10 min;
3. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,将离心管倒置于一干净滤纸上,将培养基控干;
4.用 40 mL 冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,用加样枪冲吸,使菌体尽可能分散。

冰上放置 30 min;
5. 4℃, 4 000 rpm离心 10 min收集细菌,倒出上清,再用 4 mL冰预冷的 CaCl 2悬浮细菌,这些细菌可以立即使用,或者于 4℃放置 12~24 h以增加其敏感性后使用。

6.如果证明所制备的感受态细胞可用,可以在冰上分装为100 μL每管,再加入100 μL甘油(注意:甘油非常黏稠,吸取时应该多一点。

,于液氮或 -70℃冰
箱中存放。

存于低温下的感受态细胞, 一定不能融解。

如果已经融解, 应丢弃, 而不能再冻结保存而继续使用。

注意事项:
1.本实验室所用空白大肠杆菌菌株为 JM109。

空白菌可以于平板上划线后,用Parafilm 包好后存于 4℃,也可将液体培养物存于 4℃。

但如果要长期保存, 则应将细菌保存于 50%的甘油中,存于 -20℃或 -70℃。

当接种的细菌是来自于 -20℃或 -70℃存放的液体培养物时,接种应迅速,不等解冻,立即从表面刮下一块冰后,将菌种迅速放回低温存放;
2. 一般于 3 mL LB培养基中过夜培养 12 h后, 菌体已很浓, 可以进行扩大培养。

于 100 mL培养基中培养 2~3 h后,即可达到对数生长期。

但有时如果由于存
放过久,或者已经过数次解冻,造成细菌生活力下降,则倍增时间会延长; 3.对 OD 值的监测,当肉眼看到菌体已很浓时,于超净台上取 3 mL测 OD 值。

开始可以每 30分钟检测一次,越到后面检测的时间就应该缩短;
4.感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。

因此,所有操作均应在超净台上。

也可以在实验台上进行, 但应在后面放一酒精灯, 所有操作都不能远离火焰。

最好每次恰好做感受态之前, 将所有的枪头和管子都灭一下菌, 用酒精棉球将加样枪的前端擦拭一遍;
5.感受态细胞的细胞膜比较脆弱,因此一当用冰冷的 CaCl 2悬浮以后,即不能剧烈震荡或快速抽吸;
6.根据我们的经验,纯度较高的含结晶水的 CaCl 2可以得到好的实验结果;
7.所有的枪头和管子均应干净。

如果有可能,都尽量用新的。

如果是用的回收的枪头,一定要看管壁是否干净。

8.扩大培养用的液体培养基体积可以调整。

调整后的 CaCl 2溶液体积也按比例作相应的放大或缩小。

9.以本方法制备的感受态细胞的感受效率将随低温保存时间的延长而下降,所以最好是现做现用。

存于低温下的感受态细胞应该在一个月内使用。

而对于转化PCR 连接产物,建议用其它的感受效率更高的制备方法。

本节后的附 4介绍了一种高感受效率感受态细胞的制备方法。

质粒 DNA 的转化
— LB 液体培养基:见感受态细胞的制备;
— LB 固体培养基:于液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉。

不用在灭菌前溶化琼脂粉,灭菌完后,轻轻摇匀。

注意不能剧烈摇动,否则可能会使培养基暴沸; — LB 平板:将灭菌后的固体培养基冷至 60℃左右时, 倒入 90 mm的培养皿中 (约 30 mL。

如果先前已加入了抗生素,则还应在超净台上晃动培养皿几次; —200 μL枪头, 1.5 mL Ep管,灭菌;
— 42℃水浴;
—10 μL, 200 μL加样枪;
—培养试管,灭菌;
—恒温摇床,恒温培养箱;
—菌液推棒;
—抗生素储液,本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类,氨卞青霉素(Amp (储液, 100 mg/mL,溶于无菌水中,工作浓度100 μg/mL,即每毫升培养基取1 μL
储液 ;四环素(Tet (储液, 5 mg/mL,先用 1/2体积的乙醇溶解, 再加入 1/2体积的无菌水, 工作浓度50 μg/mL, 即每毫升培养基取10 μL储液。

储液全部于 -20℃保存 ;
—冰;
1.如果是冻存的感受态细胞,先于冰上溶解;
2.加入用于转化的质粒DNA 1 μL;
3.冰上放置 30 min;
4.于 42℃热击 60 s;
5.迅速放于冰上, 5 min后进行下一步;
6.将已摄取了外源遗传物质的感受态细胞加入培养试管,该培养试管有已预热至 37℃的 LB 液体培养基,使总体积为 1 mL,温和震荡(200 rpm左右培养 1 h;
7, 将复苏的培养物倒入一 Ep 管中, 4℃, 4 000 rpm离心 10 min, 将培养基倒掉,
用残留的培养基悬浮,然后用加样枪将菌液加到 LB 平板上,用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体,将有培养基的一面向下培养约 30 min 后,倒置培养过夜。

注意事项:
1.热击时间要根据所用管子的传热效率,薄壁管子的传热效率高,热击时间可以缩短到 45 s;
2.热击时,要使水浴尽可能不要流动,热击后应迅速放回冰上;
3.于 37℃复苏细菌时,不能加抗生素,摇动也不能太过于剧烈;
4.对照的设置对于评价转化结果非常重要,将10 μL感受态细胞分别涂布于不含抗生素或含有抗生素的平板上, 如果感受态细胞没有问题, 则应该在不含抗生素的平板上生长,而在含有抗生素的平板上不能生长。

5.一般转化细胞可以用其中的 1/3涂布一个平板, 2/3涂布一个平板。

不过,对于多拷贝质粒,也可以不用离心,取50 μL涂布一个平板足矣。

质粒 DNA 的提取
—储液:100 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0:称取 Tris 12.1 g, 用浓 HCl 调节 pH 为
8.0, 然后定溶至 100 mL, 灭菌后存于 4℃; 100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0:称取 18.6
g 二水乙二胺四乙酸二钠,加 80 mL 去离子水,加热溶解,用固体 NaOH 调节 pH 为 8.0, 然后定溶至 100 mL, 灭菌后存于 4℃; 100 mL 10% SDS, 称取 10 g十二烷基硫酸钠
于 80 mL去离子水中, 加热溶解后存于室温; 2 mol/L NaOH 10 mL, 称取 0.8 g固体NaOH 溶解, 定溶至 10 mL, 于塑料瓶中室温存放,可以不灭菌。

—溶液 I :每配制 100 mL, 称取葡萄糖 0.9 g (50 mmol/L, 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 2.5 mL (25 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH8.0 2 mL (10 mmol/L,定溶至 100 mL ,灭菌后存于 4℃;
—溶液 II :现用现配,每100 μL需要2 mol/L NaOH 10 μL (0.2 mol/L, 10% SDS 10 μL (1%,然后加80 μL无菌水;
—溶液 III :每 100 mL 称取 KAc 49.1g, 于 70 mL 去离子水中溶解,然后加入冰
乙酸 11.5 mL,定溶至 100 mL后,灭菌存于 4℃;
— TE (pH 8.0:每 100 mL取 1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0储液 1 mL (10 mmol/L, 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0 0.2 mL (1 mmol/L,定溶至 100 mL后,灭菌存于 4℃; —无 DNase 的 RNaseA :将 RNaseA 溶于 10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5, 15 mmol/L NaCl 中,使终浓度为 10 mg/mL,于 100℃加热 15分钟,缓慢冷至室温,然后存于 -20℃;
— Tris 饱和酚 (pH 8.0;
—氯仿 /异戊醇(24:1 ;
— 100%乙醇与 70%乙醇,均于 -20℃存放;
— 1.5 mL Ep管, 200 μL及 1 mL枪头,灭菌;
—40 μL, 200 μL, 1 mL加样枪;
—滤纸, 1.5 mL Ep管;
—冰;
1.接种一单菌落于 3 mL 含相应抗生素的培养试管中,于 37℃剧烈振荡培养过夜;
2.将全部培养物分两次倒入 1.5 mL Ep管中 ,12 000 g 离心 1 min收集细胞 ;
3.将 Ep 管倒置于一干净滤纸上,将培养基尽可能流尽;
4.将细菌沉淀重悬于200 μl冰预冷的溶液 I 中,剧烈振荡使细菌沉淀分散;
5.加400 μL新配制的溶液 II ,盖紧管口,轻柔的快速颠倒 Ep 管 5~10次,然后将Ep 管于冰上放置 5 min;
6.加300 μL用冰预冷的溶液 III ,盖紧管口,将 Ep 管颠倒混合 15次左右,然后将Ep 管于冰上放置 5 min;
7. 2℃, 12 000 g 离心 5 min ,将上清转入另一 Ep 管,加等体积的酚 /氯仿,振荡混匀, 2℃, 12 000 g 离心 5 min;
8.吸出上清,再加等体积的氯仿抽提;
9.在吸出的上清中加入 2倍体积冰冷的乙醇于室温沉淀 2 min;
10. 2℃, 12 000 g 离心 5 min,倒出上清,沉淀用 70%乙醇洗两次。

然后倒置于
一滤纸上,让乙醇挥发干净;
11.高拷贝质粒溶于含5 μL RNaseA的50 μl TE中;低拷贝数质粒减半。

注意事项:
1.细菌培养时间不宜过长,一般以 12~16 h 为宜,如果培养时间过长,培养物会非常粘稠,这会导致离心沉淀的困难;
2.一般细菌培养好以后,应该马上提取。

如果不能马上提取,于 4℃存放时间不能过长;
2.加溶液 I 分散细菌沉淀比较关键,如果分散不好,将直接影响产率;
3.溶液 I 加入后,溶液会非常浑浊,加入溶液 II 颠倒几次后,溶液变清,打开管口,会发现溶液呈鼻涕样,加入溶液 III 颠倒后,会发现有沉淀物形成,该沉淀物位于溶液上层。

如果发现沉淀不能自动聚集, 而是呈烂棉花状, 且离心后不能沉到管底,则预示着实验的失败;
4.培养基的成分非常复杂,如果去除得不太干净,则有可能影响到后面的酶切效果;
5.乙醇必须去除干净,否则会造成电泳点样时上漂;但样品又不能干燥太久, 否则有可能使得质粒 DNA 沉淀难于溶解在 TE 中。

6. SDS 在低温下会析出结晶,因此配制溶液 II 时应先于 60℃溶解;
7.如果一次要提多个样品,可以先一起配制溶液 II ,而后加入每管。

但配制时应略大于所需要的量;
附:
1.苯酚的平衡
—重蒸苯酚
— 8-羟基喹啉
—水浴锅
—固体 Tris
— 50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0: 称取 6.055 g Tris,溶于 800 mL蒸馏水中,用浓
HCl 调 pH 为 8.0,定容到 1 L。

1.将重蒸酚于 65℃水浴融化;
2.取 100 mL融化的重蒸酚于一 250 mL烧杯中,马上加至少等体积的蒸馏水, 同时加入 0.1%苯酚体积的 8-羟基喹啉,然后加入少量的固体 Tris ,当 Tris 溶解后,可看到液面分层出现,加 Tris 用 7.6~8.5的精密 pH 试纸调 pH 为 8.0 (待加入的 Tris 溶解充分后,停止搅拌,待分层完全出现后,再用 pH 试纸测上相的 pH 值。

3.将上清吸出,加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0,充分搅拌后,测定上清的 pH 值。

如果不到 8.0,则还需要调节。

4. 将上清吸出, 再加入 100 mL 50 mmol/L Tris (pH 8.0, 充分搅拌后, 吸出上清, 但要在液面上保留一层液体。

倒入棕色瓶中,于 4℃保存。

这样的饱和酚可以使用 2个月。

如果超出 2个月, 则应倒入专用的盛装回收酚的棕色瓶中, 再重新平衡。

注意:
1. 酚有强烈的腐蚀性,所以操作时一定要小心,注意不能溢出或溅出,并且要戴手套。

如果不小心溅到皮肤上,用大量的水冲洗,切忌用乙醇! !
2. 由于酚的腐蚀性,所以不用 pH 计调 pH 值,只能用 pH 试纸。

3. Tris一定要溶解充分后,再测定 pH 值。

2.核酸样品中蛋白质的去除
— 3 mol/L NaAC(pH 5. 2 :称取 40.824 g NaAc·3H 2O 或无水 NaAc 24.6 g,溶于30 mL水中, 加 HAc 调 pH 至 5. 2, 用水定溶至 100 mL(调 pH 时,愈到后面, 愈应小心。

然后灭菌存于 4℃。

如果是浓缩 RNA ,还要用 DEPC 处理后再灭菌。

—枪头和管子:根据纯化样品的不同而采取不同的处理方式,纯化 DNA 时只需灭菌,纯化 RNA 时则需要 DEPC 处理后再灭菌。

— Tris 饱和酚 (pH 8.0;
—氯仿 /异戊醇(24:1 ;
—冻存于 -20℃的无水乙醇和 70%乙醇
1. 在核酸样品中加入 1/2样品体积的 Tris 饱和酚和 1/2样品体积的氯仿 /异戊醇, 混匀后,于 2℃, 12 000 rpm离心 5 min,将上清转入一新管中,重复酚 /氯仿抽提直至界面无可见的沉淀物为止。

2. 加入 1倍样品体积的氯仿 /异戊醇, 混合均匀后, 于 2℃, 12 000 rpm离心 5 min, 将上清转入另一新管。

3.加入 1/10终体积的 3 mol/L NaAC (pH 5. 2 ,再加入 2倍体积的冰冷的无水乙醇,于 -20℃至少沉淀 3 h。

4. 2℃, 12 000 rpm离心 15 min。

沉淀用 70%的乙醇表面润洗 2次,将管倒置于一滤纸上,空气中干燥。

然后将样品溶于适量体积的溶剂中。

注意:
1.混匀方式要根据 DNA 和 RNA 而有所不同:RNA 混匀时,可以剧烈震荡, 而DNA 只能用手颠倒混匀。

2.吸取上清液应根据待纯化的样品是 DNA 还是 RNA 而有所不同:DNA 吸取要缓慢, RNA 则可以不加注意。

3.所加乙醇的体积是以加了盐后的体积计算的。

4. 如果待纯化的核酸样品量太少 (<1µg 或样品太稀 (<0.01µg/µl, 则所加乙醇的量应扩大到 2.5~3倍。

3.核酸的浓缩
以上所述的去除核酸中的蛋白质后, 再用乙醇沉淀即为核酸的浓缩。

如果核酸样品已经很纯,则沉淀时无必要加入醋酸盐;如果核酸样品中还有杂质需要去除, 则还应加入醋酸盐(NaAc, KAc或 NH 4AC 。

4.高感受效率感受态细胞的制备
— E. coli JM109或其它菌种
— LB 液体培养基
— 50 mL离心管
— LB 固体培养基
— LB 平板
—200 μL枪头, 1.5 mL Ep管,灭菌;
— 42℃水浴;
—10 μL, 200 μL加样枪;
—培养试管,灭菌;
—恒温摇床,恒温培养箱;
—菌液推棒;
—抗生素储液,本实验室所有的质粒筛选所用的抗生素有两类,氨卞青霉素(Amp (储液, 100 mg/mL,溶于无菌水中,工作浓度100 μg/mL,即每毫升培养基取1 μL 储液 ;四环素(Tet (储液, 5 mg/mL,先用 1/2体积的乙醇溶解, 再加入 1/2体积的无菌水, 工作浓度50 μg/mL, 即每毫升培养基取10 μL储液。

储液全部于 -20℃保存 ;
—冰;
— SOB 培养基 (1L; 蛋白胨 20 g, 酵母抽提物 5 g, NaCl 0.58 g, KCl 0.38 g,100×镁离子母液 (每 100 mL含 MgCl 2·6H 2O 20.33 g, MgSO4·7H 2O 24.65 g 10 mL。

用1 mol/L NaOH调 pH 至 7.0。

— SOC 培养基:SOB+20 mmol葡萄糖(每 100 mL SOB培养基中加入 50%的葡萄糖溶液720 μL。

— 0.5 mol/L CaCl2:7.35 g CaCl2·2H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中。

用0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌。

— 1 mol/L KCl:7.45 g KCl溶于 100 mL ddH2O 中,高压灭菌。

— 0.45 mol/L MnCl2; 8.9 g MnCl2·4H 2O 溶于 100 mL ddH2O 中,高压灭菌。

— 0.5 mol/L(K-MES :9.76 g 2(-N-吗啡啉乙磺酸溶于约 80 mL ddH2O 中,
用 KOH 调 pH 为 6.2,加水定容至 100 mL,用0.22 μm 的微孔滤膜过滤除菌。

分装后于 -20o C 保存。

—二甲基亚砜(DMSO 。

— TB 缓冲液:10 mmol/L K-MES (pH 6.2 (0.5 mol/L K-MES (pH 6.2 2 mL , 45 mmol/L MnCl 2 (0.45 mol/L MnCl 2 10 mL, 15 mmol/L CaCl 2 (0.5 mol/L CaCl 2 3 mL , 250 mmol/L KCl (1 mol/L KCl 25 mL, ddH 2O 60 mL。

(用上述已经灭菌的母液配制,容量瓶事先也应灭菌。

—超净工作台,电热恒温水浴,分光光度计,离心机。

1.接种一环 E.coli JM109于 2 mL SOB 培养基中, 37℃培养过夜;或者将低温下保存的 E.coli 解冻后,于 LB 平板上划线。

2.取 0.5 mL过夜培养物或挑一个单菌落于 50 mL SOB中,于 18℃摇床中培养16-24 h至 OD 600值达到 0.6。

3.取出摇瓶置于冰浴中 10 min,转入 50 mL离心管中, 4000 rpm离心 10 min, 弃上清液,将菌体悬浮于 16 mL预冷的 TB 缓冲液中,再置于冰浴中 10 min后离心收集菌体。

4. 将菌体重新悬浮于 4 mL TB缓冲液中, 加入 280 µL DMSO使其终浓度为 7%, 并轻轻摇匀,冰浴至少 10 min ,将感受态细胞分装入 EP 管中并置于液氮中冷冻 5 min以上 (此时的感受态细胞可于液氮中保存 40天以上而不影响转化频率。

5.取出 EP 管让其在冰浴上自然解冻,取 200 µL 解冻的感受态细胞与 1-10 µL DNA 混合,冰浴 30 min后,于 42℃热冲击 60 s,立即置于冰浴中, 5 min后进行下一步。

注意:从液氮中取出的 EP 管应迅速打开盖子,否则 EP 管可能爆裂伤人! 6.向热冲击后的 EP 管中加入 0.8 mL的 SOC 培养基,使总体积为 1 mL, 37℃温和震荡(200 rpm左右培养 1 h;
7. 将复苏的培养物倒入一 Ep 管中, 4℃, 4 000 rpm离心 10 min, 将培养基倒掉, 用残留的培养基悬浮,然后用加样枪将菌液加到 LB 平板上,用推棒涂布直至培养基表面无可见的液体,将有培养基的一面向下培养约 30 min后,倒置
培养过夜。