第4章 酶的分离纯化

空间结构的稳定性
有活性的酶的空间稳定性有限，不同的酶 可能有不同的稳定性 保持稳定性的环境因素 离子强度适当 最适pH 低温 加入稳定性：甘油、糖类、聚乙二醇等
第一节 酶的分离纯化策略
一、酶分离纯化基本原则 ① 防止变性失活 ② 低温进行 ③ 防止局部的过酸过碱 ④ 避免剧烈搅拌和泡沫形成 ⑤ 重金属离子能引起酶失活，有机溶剂会使酶失 活，微生物污染以及蛋白酶的存在会使酶分解 破坏， ⑥ 其他因素：水质、辅因子等
第四章 酶的分离与纯化
1.酶的分离纯化策略 2.酶液的制备与初分离 3.酶的分离纯化方法 4.酶纯度的检验
酶的提取和分离纯化是指把酶从组织中、 细胞内或细胞外液中提取出来并使之达到 与使用目的相适应的纯度。 酶的分离提纯包括三个基本环节： 一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成 酶溶液； 二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从 酶溶液中把酶分离出来； 三是制剂，即将酶制成各种剂型。
4、有机聚合物沉淀法
在酶液中加入某些高分子物质，使其与酶 形成聚合物而沉淀下来，从而使酶与杂质 分离的方法称为有机物聚合法。 SDS PEG 丙烯酰胺
5、萃取分离
萃取分离：利用溶质在互不相溶的两相间 分配系数不同而使溶质得到纯化或浓缩的 方法。
（1）双水相萃取
将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合， 当聚合物达到一定浓度时，体系自然分成 互不相溶的两相，从而构成双水相体系。
一、根据溶解度不同而建立的纯化方法
酶的性质：水溶性 基于物理、化学规律， 酶分子的疏水基团一般 位于分子内部，带电和 强极性基团位于分子表 面，形成极性表面。进 而水分子被结合在极性 表面形成水化层，使酶 分子具有一个很亲水的 表面而易溶于水。
调节酶溶解性的方法
1、盐析法 在低浓度盐溶液中，其溶解度随盐离子强 度升高而加大，表现出盐溶现象。原因： 盐离子与蛋白质分子中的极性基团或离子 基团作用，降低蛋白质分子的活度系数而 使其溶解度增加。 当盐浓度继续升高达到某一上限值时，其 溶解度又会以不同速度下降。分别沉淀析 出，这种现象称为盐析。
饱和度：溶液中饱和硫酸铵的体积与溶液 总体积之比。 当蛋白质溶液体积不大，要达到的盐浓度 不高，可加入饱和硫酸铵溶液，100m1硫酸 铵溶液，由饱和度S1变为S2，应向其中加 入的饱和硫酸铵溶液的ml数(V)为： V＝Vo(S2—S1)/(1—S2)
当蛋白质原有体积较大，要达到的盐浓度 又较高，此时加入固体硫酸铵为宜。在0℃、 25℃下，硫酸铵浓度由饱和度Sl增至 S2．应向1L溶液中添加的固体硫酸铵的克 数，可以直接查表:
盐析法注意方面
盐析法适宜的pH是接近分离酶的PI值.可控 制pH＜5或pH＞6，使目的酶与杂蛋白带相 同电荷而减少与它们的结合 从酶的稳定性和溶解度来看，盐析温度应 控制在0℃左右为宜。 蛋白质浓度应在1mg/ml以上。 经盐折后,沉淀通过离心或压滤与母液分 开，收集后的沉淀再溶于一定的缓冲液心 除去不溶物,酶溶液又得到一次纯化。
胞外酶：释放到细胞外的酶 胞内酶：游离在细胞内的酶和牢固与膜或 细胞颗粒结合在一起的酶
沉淀法
胞外酶
酶泥
用盐析，或单宁沉淀.有机溶剂沉淀
细胞壁的主要组分： 细菌：肽聚糖、N-乙酰葡糖胺、 N-乙酰胞壁酸 真菌和酵母：葡聚糖、甘露聚糖 藻类：纤丝状糖类 动物细胞无细胞壁，易破碎。
细胞破碎的方法
注意事项
一般在进行有机溶剂法时，溶液pH尽可能 靠近待纯化酶的PI值。 加入适当的中性盐，如5％一10％硫酸铵往 往有助于提高分离效率。但其浓度不得越 过0.05mol/L。 此法分辨率较高、溶剂易除去，但易引起 酶的变性失活。
3、等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 以及不同的两性电解质具有不同的等电点 这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或 杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方 法称为等电点沉淀。
（3）凝胶过滤：利用葡聚糖凝胶G-25或G-50 等能吸水膨胀，而酶等大分子排阻于胶外 的原理进行的一种浓缩。 （4）沉淀法 利用盐析法或有机溶剂沉淀法将蛋白质进 行沉淀，再将沉淀溶解在小体积的样品溶 液中。 （5）渗透浓缩法 将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在封闭 容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外。
抽提缓冲液可能组成成分
pH调节剂 离子强度调节剂：盐类 构象稳定性：甘油 抗氧剂：DTT、巯基乙醇等 重金属络合剂：EDTA、柠檬酸 蛋白酶抑制剂：PMSF、DFP等 增溶剂：Triton X-100等
影响酶提取的主要因素 （1）pH （2）温度 （3）抽提液的用量
离心
离心转数：每分钟转数（rpm） 离心分离强度：g值 换算：g=（rpm×2π/60)2/9.8 r:粒子距离轴中心的距离 低速：≦4000rpm 高速：4000-20000 rpm 超速: ＞20000 rpm
双水相适合进行的酶萃取
两相中含有70%以上的界流体萃取是将超临界流体 （supercritical fluid）作为萃取溶剂，利用 欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度 不同而达到分离的一种萃取技术。 超临界流体：物质状态超过气液共存时的 最高压力和最高温度下物质特有的点—临 界点后的流体。
JY92-II D超声波
细胞粉碎机
高 压 细 胞 破 碎 机
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
（2）化学渗透：将细胞壁溶解作用和渗透压 作用相结合，使细胞膜破裂而释放出胞内 物质。
有机溶剂处理：溶解膜脂、干燥、抽提。
表面活性剂处理：改变膜的通透性，使之 溶解，再抽提蛋白。SDS、Triton
（3）酶溶解：利用溶解细胞壁的酶处理菌体， 使细胞壁受到部分或完全破坏后，再利用 渗透压冲击而破坏细胞膜。
建立以下分析通道： ① 快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法（酶 活力测定方法） ② 蛋白质纯度检测方法 ③ 总蛋白的检测方法 ④ 对必须清除的杂质分析方法
此外，还需尽量做到 ① 纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件 ② 减少添加剂的使用 ③ 尽早去除有破坏型的杂质 ④ 尽早采用高效分离方法，将最昂贵、最费 时的分离方法防在最后阶段。
超临界流体的物理特性和传质通常介于液 体和气体之间，超临界流体的黏度大大低 于液体的黏度，接近气体的黏度，有利于 物质扩散。其扩散系数接近于气体。 由于溶质在超临界流体中的溶解度随温度 和压力的变化很大，超临界流体对于物质 的萃取具有选择性。 常用的超临界流体是二氧化碳。
（3）反胶团萃取
反胶团（reversed micelles）：两性表面 活性剂在非极性有机溶剂中亲水基团自发 地向内聚集而成的微小胶团。 表面活性剂的存在是构成反胶团的必要条件 阴离子型表面活性剂 阳离子型表面活性剂 非离子型表面活性剂
二、酶的分离纯化策略
1、目的明确 用途：
医疗用途、活体研究等 极高纯度＞99% X射线结晶、物理化学性质研究等 高纯度95-99% N端测序、生产抗原等 一般纯度＜95%
2、建立一个可靠、快速的分析方法
目标酶蛋白，蛋白质纯度的检测，总蛋 白量的检测，对必须清除的杂质的分析
纯化方法的选择--解决纯化倍数和回 收率的矛盾
实验室的离心机
常温和冷冻 超速离心机为冷冻 使用冷冻离心机需先降 温，预冷离心机头 使用超速离心机要抽真 空
离心的形式
角式及外摆式：外摆式一般为低速，角式 从低速到超速。
角式离心头要配套，低温使用预冷，操作 注意稳、盖、胶圈、旋紧。
离心机：落地式、台式
小台式离心机
超速离心机
离心机管
盐析操作
低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合 均匀，一般终饱和度不超过40%。 加量估算：假定混合总体积不变。 高饱和度：加固体盐添加法，不会大量增加 溶液体积。 温和搅拌添加，加毕后继续搅拌10分钟以上， 以充分沉淀。 沉淀后要高速离心分离，还需除盐。
2、有机溶剂沉淀法
（1）原理：利用酶等蛋白质在有机溶剂中的 溶解度不同而使之分离的方法。 与水相容的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮 等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 有机溶解的主要作用是降低溶液的介电常 数，因为分子中的静电引力和溶剂的介电 常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子 间的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解 度降低。 另一作用引起蛋白质脱水而沉淀。
（4）冻结-溶冻法
三、抽提
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或 溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液 中的过程，也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择 适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶 剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中， 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸 性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀 盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较 多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。
原理：利用酶和杂质蛋白等在不混溶的两 个水相系统中分配系数不同而达到分离的 目的的方法。
双水相的形成主要是由于高聚物之间的不 相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用， 互相无法渗透，形成不了均一相，从而具 有分离倾向，在一定条件下分成两相。 聚合物/聚合物：聚乙二醇/葡聚糖、聚丙 二醇/聚乙二醇 聚合物/盐：聚乙二醇/(硫酸盐或磷酸盐）
1. 机械法 2. 物理法：渗透压突变、超声波、冻融、冷 冻干燥再抽提 3. 化学法：有机溶剂处理、表面活性剂处理 4. 生物法（酶法）：糖苷酶、溶菌酶葡聚糖 酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等
胞内酶？细胞破碎取酶
（1）机械破碎法 液体剪切：搅拌、匀浆 固体剪切：研磨、珠磨、捣碎
细 胞 破 碎 珠
酶的分离纯化一般程序可以分为 ① 预处理：包括材料的选择、发酵液的预处 理和细胞的破碎等。 ② 粗分级分离：等电点沉淀、盐析、有机溶 剂沉淀、萃取和离心分离。 ③ 细分级分离：通常用色谱分离 ④ 成品制作：透析、超滤、结晶和冷冻干燥 等。
第二节 酶液的制备和初分离
一、材料的预处理 动物材料： 除去与实验无关甚至有妨碍的结缔组 织， 脂肪组织和血污等。 植物种子需要除壳 微生物材料需将菌体和发酵液成分分开
材质：玻璃、 塑料 强度和离心 机转速配备 大小：和转 子相配备 高速和超速 管要加盖
离心机操作
平衡、定温、定速、定时、定刹车
四、浓缩
（1）蒸发 工业上应用较多的是薄膜蒸发浓缩，即将 待浓缩的酶在高真空度的条件下变成极薄 的液膜，并使之与大面积热空气接触，让 其中的水分瞬时蒸发达到浓缩的目的。 （2）超滤 在加压情况下，将待浓缩溶液通过一层只 允许水分子和小分子选择性透过的微孔超 滤膜，而将酶等大分子滞留，从而达到浓 缩的目的。
不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不 同盐浓度下沉淀。浓盐中蛋白质的溶解度 遵循Cohn方程：
S：为溶解度 S0：离子强度为0时溶解度 Ks：盐析常数 I：离子强度
盐析影响因素
pH值：等电点处最易沉淀 温度：浓盐溶液中，温度升高溶解度下降 盐种类：高价盐效果好，常用硫酸铵，一 般用氨水调pH。浓度经常用饱和度（换算 表） 蛋白质浓度：过稀回收困难，过浓易沉淀。
第三节 酶的分离纯化方法
（1）根据溶解度大小分离的方法、如盐析法、有机 溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点 沉淀法等。 （2）根据分子大小的差别。如离心分离法、筛膜分 离法、凝胶过滤法等。 （3）根据电学、解离性质差别，有吸附法、离子交 换色谱法、电泳法以及聚焦色谱法。 （4）基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂具有专一 的亲和作用特性而建立的各种亲和分离法。 （5）利用稳定性差异而建立的选择性热变性、酸碱 变性和表面变性法等。
3、纯化方法的选择
评定好坏的标准： ① 比活力提高倍数 ② 总活力的回收率 ③ 重现性
① 比活力提高倍数是纯化后样品的酶比活力 与纯化前比活力的比值，较大的倍数表示 比活力明显提高，说明操作的有效性。 ② 总活力的回收率是指纯化后样品的总活力 占前样品总酶活的百分比。这一比值越高 说明该操作步骤对酶活的保存率越高。 ③ 较好的重现性是所有方法可行性的必要条 件。