EDC-NHS

EDC-NHS
引言
Thermo Scientific公司的NHS和磺基-NHS，被用于化学标记、交联和固相固定中，制备氨基羧酸酯的胺反应酯。

在存在碳二亚胺类化合物如EDC时，羧化物(-COOH)可能与NHS或者磺基-NHS反应，形成一个半稳定的NHS或者磺基
-NHS酯。

NHS或者磺基-NHS酯可以继续与伯胺(-NH2)反应，形成酰胺键(amide crosslinks)。

虽然NHS或者磺基-NHS在碳二亚胺反应中不是必须的，但它们的使用可以极大的提高偶联效率。

另外，使用NHS或者磺基-NHS可以使反应分两步进行。

NHS或者磺基-NHS均为水溶有机溶剂。

然而，用NHS活化，降低了修饰后羧酸盐的水溶性，而使用磺基-NHS活化，由于荷电磺酸基，则可以保存或者增加修饰后分子的水溶性。

虽然准备的NHS或者磺基-NHS酯在两步反应中足够稳定，仍然会在几个小时或者几分钟内水解，时间的长短取决于水中物质和反应液的pH值（NHS酯半衰期为：pH7时为4-5小时，pH8时为1小时，pH8.6时为10分钟）。

提取和干燥的操作流程可以调整为适于准备稳定的NHS活化分子，但最优的情况是NHS活化后的分子立即与含有氨基的目标分子反应。

使用EDC和磺基-NHS的活化反应，最适pH值4.5-7.2，EDC反应通常在pH
4.7-6.0的MES缓冲液中进行。

磺基-NHS活化后的分子与伯胺反应的最适pH值7-8。

磺基-NHS酯反应通常在pH 7.2-7.5的PBS中进行。

为了得到两步反应的最优结果，第一步反应最好使用pH5-6的MES缓冲液（或者其他不含氨基、不含羧基的溶液）,然后在与含有氨基的分子反应之前，立即用磷酸（盐）缓冲液（或者其他非氨基缓冲液）提高pH值至7.2-7.5。

EDC反应用2-巯基乙醇(2-ME)终止，或者过量的试剂通过有脱盐作用的柱子来交换缓冲液而除去。

用伯胺和羧酸盐的EDC/NHS交联过程
A. 其他需要准备的材料
活化缓冲液：0.1M MES (2-吗啉乙磺酸)，0.5M NaCl，pH 6.0 PBS：0.1M磷酸钠，0.15M NaCl, pH 7.2-7.5
蛋白1溶液：用活化缓冲液配置1ml的蛋白1溶液，10mg/mL 蛋白2溶液：将蛋白低压冻干或者溶解在1-10mg/mL 的PBS或者其他不含氨基的溶液中，pH 7-8
EDC：为了最优的实验结果，EDC与蛋白1溶液的用量摩尔比为10.
备选：2-巯基乙醇用来终止EDC反应
备选：羟胺用来终止氨基反应。

B NHS酯的活化
1. 加入0.4mg EDC（终浓度2mM）至1ml的蛋白1溶液，假设蛋白分子量50kDa，
EDC与蛋白分子的摩尔比为10.
2. 加入0.6mg的NHS或者1.4mg的磺基-NHS至反应体系中（终浓度5mM）。

3. 充分混匀，室温放置15分钟。

4. 加入1.4ul的2-巯基乙醇(终浓度20mM)灭火EDC
C 氨基反应
1．用浓缩的PBS或者其他不含氨基的溶液如碳酸氢钠，提高溶液的pH值大于
7.0
2．将蛋白2溶液加入活化后蛋白1溶液中
3．充分混匀，室温反应2小时
4．备选：加入羟胺至终浓度10mM来灭活。

过量的羟胺与蛋白1表面剩余的所有NHS酯反应，将羧基变为羟肟酸。

备选的灭活试剂包含20-50mM Tris、赖氨酸、甘氨酸和乙醇胺。

pH提高至8.0可以增加NHS酯的水解，羧基重新形成。