小鼠MCAO总结

小鼠MCAO模型
一、实验器材：
1.手术器械：眼科剪1、显微剪1、钩镊1、直镊1、显微镊2、止血钳1、持针器1、缝合
线(2-0/5—0)、缝合针、麻醉剂：10％水合氯醛(350mg/kg）
2.栓线：0。

18mm（20～25g）、0。

20mm (25～30g）；在栓线10mm的位置用黑色记号笔
标记;75％酒精清洁后置1： 2500单位肝素化生理盐水中备用。

3.其他用品：酒精棉球、75%酒精、生理盐水、注射器(1ml、2ml）、黑色记号笔、固定鼠用
粗线绳、鼠板
二、步骤：Zea Longa 线栓法
1.麻醉：10％水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）
2。

术前准备：仰卧位固定大鼠，备皮消毒
3。

分离血管及挂线：
1)自胸骨柄到下颌骨间取长约1cm 正中切口。

见下颌下腺，将其分离至两侧；
2)见右侧肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、二腹肌形成的三角区,镜下分离此三角区内,暴露右侧颈
总动脉(CCA）、颈外动脉（ECA)、颈内动脉(ICA）；
3)首先分离CCA于其上挂线1；
4)随后向头侧分离ECA血管及其分支，于ECA上头尾侧分别挂线2、3；
5)然后清除CCA分叉部脂肪，观察ECA分支与ICA关系，分离ICA及ECA分支,于其上
挂线4;
6)注意操作轻柔避免迷走神经、舌咽神经、气管损伤,避免过度牵拉血管使其严重移位或断
裂。

5.结扎：死结：线1、2;活结:线4；不系结：线3
6.剪口插入:
1)将鼠台逆时针旋转90°,在ECA上距分叉1～1.5mm用显微剪剪一切口；
2)将标记好的线栓由此切口插入CCA 中；
3)将鼠台转回，将线栓从CCA拔出至分叉稍尾侧,右手将线栓转向滑入ICA，右手拉开线4
活结，后继续插入ICA，待有阻力时再进入少许，深度1cm+,到达大脑中动脉与前交通之间；
4)顺利插入后将丝线4扎紧,抽出线3减去多余线头。

6.缝皮
7.术后:小鼠俯卧位，头略抬高,至于温湿度适宜环境.
三、注意事项:
1.雌性鼠对于牵拉等操作的反应更强烈，故建议选择雄性大鼠作为实验对象。

2.大鼠解剖学变异：一般而言，Fisher-344大鼠MCA解剖变异较小，闭塞后形成的梗死体
积一致性好；Wistar-Kyoto 大鼠变异相对最大; 而Sprague—Dawley大鼠介于两者之间.
3.麻醉：10%水合氯醛腹腔注射(30ml/kg）, 一般可持续1～1.5h.如按标准体重计算的麻醉剂
量效果欠佳，可使用总量的10%进行追加。

需注意反复多次或过量追加易造成动物死亡, 或导致清醒推迟而影响再灌注前评分, 从而使再灌注时间不能统一界定在2h.水合氯醛可使动物呼吸频率下降50％左右，但一般不会导致动物窒息而死亡。

术中严密观察动物呼吸频率、深度及有无痰鸣音等。

4.分离气管前肌肉时注意保护好甲状腺和甲状旁腺。

甲状腺呈鲜红色，紧密贴在气管前壁
上，甲状旁腺位于甲状腺外上方, 颜色略淡。

血管分离要到位，使用电凝器可明显减少小血管的出血，从而保证手术野清晰, 尤其是肌肉内部的血管和ECA 的一些细小分支，
未明确时不可随意离断。

结扎血管时要注意力度和方向，由于血管被膜被分离后血管表面相当光滑，结扎不牢可能导致难以控制的出血；术中还要注意保护与血管紧密相依的神经, 注意观察神经的颜色、反光性和轻触时的感觉, 切勿损伤或离断。

牵拉迷走神经时可见动物呼吸明显减慢甚至血液呈深紫色, 出现肢体末端紫绀。

在无法给予辅助通气时，应暂停操作.一般来说，动物呼吸可恢复到麻醉后的平稳状态，血液颜色也可恢复到正常，这时再继续手术较为安全。

5.关于是否结扎PPA 文献报道尚不一致.可沿ICA一直分离至看到其入颅分支与PPA分叉
处,观察线栓走行状况, 若顺利将长度约1cm的线栓插入，则可固定线栓而无需对PPA 进行操作；如只进入5mm左右即遇到明显阻力，则线栓进入PPA的可能性很大，此时可将线栓撤离至ECA/ICA处，提起PPA，以帮助线栓沿ICA进入颅内而最终阻塞MCA。

6.Koizumi等1986年首次报道不开颅经CCA插入尼龙线栓致MCA闭塞；之后,Longa等进
行了改良，将栓线从ECA插入，再灌注时将栓线抽回ECA内，通过CCA实现再灌注.Koizumi使用的丝线末段均匀包被硅胶, 直径增加近30~40％, 插入后不仅可伸入大脑前动脉ACA）近端, 肯定阻塞ACA及前交通动脉，而且阻塞MCA及后交通动脉开口处，彻底阻塞MCA及其所有侧枝供应血管，形成供应区域完全缺血，因此局部梗死面积大, 均匀一致，各动物间差异较小.Longa使用的4-0尼龙线末端球形扩大，但并非直接闭塞MCA，而是依靠结扎同侧ICA和其球形扩大的末端伸入ACA腔内、阻断经前交通动脉来自对侧ACA的血流形成局灶性脑缺血，但不能阻断来自后交动脉的侧枝供应，且丝线末端伸入ACA腔内位置不同, 所起作用差异很大，因此形成的梗死面积很小，各动物之间差异较大。

宋红松等建议采用Koizumi方法.
丁香园：
1.注意尽量不要损伤在颈内颈外分叉下的交感神经节.
2.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了,有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么
也进不去了,这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度.因此,碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管.这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线,很可能前端也经变形角度变了!颈内动脉的走向为内上方，可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力，要不血管就要破了
3.栓线不能在血管里反复进退,否则及容易造成蛛网膜下腔出血,而且很容易误解为模型成功,
因为这时的神经功能改变也很明显,但并不是由于栓塞引起的
4.大鼠仰卧时，ICA从CCA分出后下行（向背侧）约5mm又分为两支A，即走向乳突泡
（Mastoid bulla）的翼腭A和进入颅内的ICA的延伸部分。

因为翼腭A的走向几乎和分支前的ICA走向相同，而ICA的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭A.进线时，用镊子将ICA轻轻往头侧推一下，使ICA和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。

或使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。

5.注意手的感觉,轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后,再插线会见到线弯曲)。

可
能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。

一个原因是线太硬,另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。

后者至关重要，请体会.
6.栓线一旦进入ACA,就要把上面提到的那根细线适度扎紧(“适度"很重要,会影响到再灌流
时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使ICA有任何的牵拉，否则栓线会脱出ACA，可能会造成缺血失败。

血管外的栓线不要留得过长,更不要缝在皮外,大鼠醒来后会自己拔出。

7.如果你用的是中长效麻醉剂,插线成功后，固定丝线,然后让其俯卧位,而且稍稍抬高其颈
部，才能确保模型成功.
8.术后一定要注意保暖.
9.插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成.
10.手术后评分的主观因素很大，有用5分制和11分制的,我个人认为用5分制比较准些.
11.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型,梗死体积出现的最小时间点可能为2h，体积随
时间进行性增大，至12h基本趋于稳定
12.整个试验是很费动物的，存在15-30%的淘汰率（如果你做的好)，但注意严格控制自己淘
汰的动物（纪录具体情况).
13.除了刚才说的蛛网膜下腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原
因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.
14.术后处理:由于术后动物尚未清醒，因此护理也很重要。

但为保证栓线成功，达到预期的
阻塞时间，防止栓线脱落暂时把动物留在手术台上，保证动物不会因挣扎而把栓线过早脱落，但仍需监测体温,并注意保暖。

再灌注后动物可放入笼中。

另外笼中应保持干燥，没有积水及粉尘，防止动物误吸而窒息。

我们在实验中发现一些模型症状不典型甚至没有症状,都是由于动物苏醒后极力挣扎使栓线过早脱落所致。

手术后大鼠存活期可以满足通常的实验需求，一般来讲,随着栓塞和再灌注损伤时间的延长，死亡率会上升。

大鼠在术后24～48小时最容易死亡，这种死亡是严重脑缺血损伤造成的，较直接的因素是脑水肿.用线栓制作持续性局灶性脑缺血模型时，术后要肌注庆大霉素预防感染;如果动物模型要生存1周以上,必要肌注速尿，防止因脑水肿动物在短期内死亡.术后饮水中加入葡萄糖,保证动物术后有充足的能量生存到实验要求的时间。

舍去标准：
⑴栓线插入深度不足18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠
⑵蛛网膜下腔出血、MCA起始部或其附近的willis环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非MCAO/Reperfusion损伤.
3）手术时出血较多,症状很重的动物。

死亡原因分析：
首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深,以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重,则表明死因是脑缺血时间太重,需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。