逆转录反应
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一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶)
最适工作温度为42℃。 具有较强的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性。 RNA酶H活性： 水解DNA和RNA杂合链中的RNA链。
逆转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、 β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各 PCR反应体系中扩增效率不均一，各孔间的温度差 等所造成的误差； 4. 防止DNA的污染，采用DNA酶处理RNA样品。
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶)
最适工作温度为37℃。 具有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较 弱。
逆转录反应
三、引物： 1、Oligo(dT)15-18：5'— TTTTTTTTTTTTTTTTTT—3‘ 2、特异性引物： 3、随机引物：
逆转录反应
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。
2.逆转录反应。
5RT-buffer
4 l
RNasin (40U/ml) 1 l
dNTPs (10mmol/L) 4 l
AMV
1 l
轻弹管底混合，离心10秒，置42oC 水浴1h。
逆转录反应
逆转录反应
四、实验操作： 1.RNA链的线性化。 2.逆转录反应。 3.终止反应。
逆转录反应
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。
总RNA
9 l
Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml)
轻弹管底混合， 置65℃水浴10min，立即冰浴 2min（防止RNA形成二级结构）。
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。 2.逆转录反应。
3.终止反应。 将上述反应移至68oC水浴10min，以灭活RTase，
然后冰浴，保存备用。
逆转录反应
五、注意事项： 1. 防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免mRNA的断裂； 2. 防止非特异性扩增，必须设阴性对照； 3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
逆转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
成DNA的反应。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶)
逆转录反应
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶)
最适工作温度为42℃。 具有较强的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性。 RNA酶H活性： 水解DNA和RNA杂合链中的RNA链。
逆转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、 β-Actin（β-肌动蛋白）等。
其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各 PCR反应体系中扩增效率不均一，各孔间的温度差 等所造成的误差； 4. 防止DNA的污染，采用DNA酶处理RNA样品。
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶)
最适工作温度为37℃。 具有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较 弱。
逆转录反应
三、引物： 1、Oligo(dT)15-18：5'— TTTTTTTTTTTTTTTTTT—3‘ 2、特异性引物： 3、随机引物：
逆转录反应
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。
2.逆转录反应。
5RT-buffer
4 l
RNasin (40U/ml) 1 l
dNTPs (10mmol/L) 4 l
AMV
1 l
轻弹管底混合，离心10秒，置42oC 水浴1h。
逆转录反应
逆转录反应
四、实验操作： 1.RNA链的线性化。 2.逆转录反应。 3.终止反应。
逆转录反应
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。
总RNA
9 l
Oligo dT (0.05g/ml) 1 l (终：2.5 ng/ml)
轻弹管底混合， 置65℃水浴10min，立即冰浴 2min（防止RNA形成二级结构）。
四、实验操作：
1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性 地结合到 PolyA 尾。 2.逆转录反应。
3.终止反应。 将上述反应移至68oC水浴10min，以灭活RTase，
然后冰浴，保存备用。
逆转录反应
五、注意事项： 1. 防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免mRNA的断裂； 2. 防止非特异性扩增，必须设阴性对照； 3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。
逆转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
成DNA的反应。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ转录反应
一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合
成DNA的反应。 二、逆转录酶：
DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶)
逆转录反应