间苯二酚与邻苯二酚对泥鳅血清卵黄蛋白原的诱导作用

间苯二酚与邻苯二酚对泥鳅血清卵黄蛋白原的诱导作用
雷忻;洪杰;王文强;王晓涧;延志莲
【摘要】为探讨间苯二酚(m-dihydroxybenzene)与邻苯二酚(o-dihydroxybenzene)对雄性泥鳅Misgurnus anguillicaudatus血清卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vtg)的诱导作用,将雄性泥鳅分别暴露于4种不同质量浓度间苯二酚(5.287mg/L、6.531 mg/L、8.072 mg/L、10.000 mg/L)和邻苯二酚(16.708
mg/L、17.742 mg/L、18.836 mg/L、20.00 mg/L)中持续7d、14 d、21 d和
28 d,采用碱不稳定性蛋白结合磷法检测血清Vtg水平的变化.结果显示,与对照组
相比,泥鳅在低质量浓度间苯二酚(5.287 mg/L)和邻苯二酚(16.708 mg/L)中暴露
7d时,血清Vtg水平均有极显著升高,并且随着暴露浓度的增加,Vtg水平逐渐升高；在同一暴露浓度下,Vtg水平随暴露时间的延长逐渐升高；2种酚类化合物相比,暴
露在间苯二酚中的泥鳅血清Vtg水平高于邻苯二酚.上述结果说明,2种化合物均可
诱导雄性泥鳅肝脏合成Vtg,具有一定的环境雌激素效应,其诱导作用随着暴露剂量
的增大和时间的延长逐渐增强.
【期刊名称】《四川动物》
【年(卷),期】2013(032)004
【总页数】5页(P563-567)
【关键词】间苯二酚;邻苯二酚;泥鳅;卵黄蛋白原;血清
【作者】雷忻;洪杰;王文强;王晓涧;延志莲
【作者单位】延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕
西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,
陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000
【正文语种】中文
【中图分类】Q959.4;R994.6
环境雌激素(Environmental estrogens)对水生生物生命活动的影响及对人类健康的潜在威胁正逐渐被人们所关注。

当今水环境污染物中有一些酚类化合物具有一定的环境雌激素效应，可影响水生动物的生长、发育和生殖，导致种群数量下降。

间苯二酚(m-dihydroxybenzene)与邻苯二酚(o-dihydroxybenzene)是重要的精细
化工中间体，广泛用于塑料、农药、抗氧化剂、染料、涂料等精细化工产品的生产。

它们具有易富集和难降解等特点，毒性可以通过食物链传递和放大，除了对水生生物产生毒害作用，还可进一步危及陆生动物、鸟类和人类的健康(陈碧娟，陈民山，1990;Rudel，1997;杜克久，徐晓白，2000;魏爱泓等，2001;李瑞霞，2006)，已成为当今水环境中重要的污染物之一。

随着陕北地区能源化工基地建设的快速发展，工业、生活废水及农药污染日渐增多，河水中酚类化合物污染有加剧之势，其对当地水生生物及人体的毒害作用不容忽视。

卵黄蛋白原(Vitellogenin，Vtg)是卵生动物卵黄蛋白的前体，雌性脊椎动物受内
源性雌激素的调节可在肝细胞中合成Vtg并释放到血液中，雄性个体在外源雌激
素或类雌激素化合物的诱导下肝细胞也可合成Vtg，因此雄性体内Vtg的异常变
化可作为生物标志物来检测环境化学污染物的雌激素效应(Yadetie et al.，1999;Chikae et al.，2003)。

赵岩等(2007)以泥鳅体内Vtg含量变化分析了双
酚A(bisphenol A，BPA)的环境雌激素效应。

刘萍等(2010)分析了金鱼体内Vtg
的变化情况，研究了几种常见的酚类化合物对金鱼的环境雌激素效应。

目前，间苯二酚和邻苯二酚对低等水生生物和鱼类的急性毒性效应已有报道(张辰佳等，2009;雷忻等，2012)，但对其环境雌激素效应的研究鲜有报道。

泥鳅Misgurnus anguillicaudatus是一种良好的土壤与水域环境污染的监测动物，隶属鲤形目Cypriniformes鳅科Cobitidae泥鳅属Misgurnus(成庆泰，郑葆珊，1987)，系一种小型淡水鱼，适应于淤泥、水体两种栖息环境，抗病能力较强，食性广，易于驯养，是一种较理想的动物试验材料(王万云等，2003)。

本研究以泥
鳅为试验动物，检测间苯二酚与邻苯二酚胁迫下，血清卵黄蛋白原水平的变化规律，分析2种酚类化合物的环境雌激素效应，为酚类化合物对鱼类的内分泌干扰作用
的研究奠定基础，从而为合理有效地进行陕北能源化工基地的建设提供一些科学理论依据。

1 材料与方法
1.1 材料与药品
实验用泥鳅购于陕西省延安市农贸市场。

在室温下，用经过3 d自然脱氯的自来
水驯养2周后，挑选健康、强壮的雄性泥鳅进行实验，泥鳅的性别根据胸鳍大小
和形状来确定(雄性:大而尖，雌性:小而圆)。

受试泥鳅平均体质量(12.3±2.5)g，平均体全长为(11.0±2.0)cm。

间苯二酚，分析纯，购自天津市天大化学试剂厂。

邻
苯二酚，分析纯，购自北京化工厂。

1.2 暴露试验
在进行正式实验之前先进行2次预实验。

根据预实验所确定的安全浓度和最大零
致死浓度，将间苯二酚与邻苯二酚分别设置4个质量浓度处理组(间苯二酚:5.287 mg/L、6.531 mg/L、8.072 mg/L、10.000 mg/L;邻苯二酚:16.708 mg/L、
17.742 mg/L、18.836 mg/L、20.00 mg/L)进行毒性暴露试验，同时设置空白对照组，空白对照组除处理过的自来水不加任何毒性物质。

每个处理组设3个平行
组，每组放置10尾雄性泥鳅。

实验开始后，每24 h更换1次受试药液，以保证
药液溶氧量、pH、水温及其他理化指标的稳定(沈洪艳等，2007)，并及时捞出死亡泥鳅。

隔天喂食少许小米和玉米碎粒，取样前一天停止喂食。

每隔一周观察鱼的活动、中毒情况以及体色的变化。

1.3 血清样品制备
分别在 7 d、14 d、21 d、28 d 处死泥鳅，断尾取血，所得血样在4℃下静置4～6 h，10 000 r/min离心15 min，取上清，－80℃冷冻保存，以备测定(Shi
et al.，2003;林浩然，刘晓春，2006;张艳珍等，2008)。

采血结束后，将泥鳅解剖，根据性腺(雄性:白色精巢，雌性:黄色卵巢)进一步鉴定其性别。

1.4 Vtg含量测定
采用碱不稳定性蛋白结合磷的方法测定血清中Vtg的含量。

将血清样品分别加入到含有10%的三氯乙酸(TCA)溶液的离心管中，0℃过夜，离心去上清;加入5%TCA溶液，90℃孵育30 min;离心去上清;分别用无水乙醇、氯仿∶乙醚∶无水乙醇(体积比1∶1∶2)、丙酮和乙醚按顺序清洗沉淀，弃去上清;加
入NaOH，100℃水解3 h，待测(林浩然，刘晓春，2006;张艳珍等，2008)。

将预处理后的样品转入比色管中，盐酸中和，加显色液(配制方法:3 mol/L H2SO4∶蒸馏水∶25 g/L钼酸铵∶100 g/L 抗坏血酸=1∶2∶1∶1)，定容，37℃孵育
1.5～2 h;用7230型分光光度计测定780 nm波长处的吸光度，根据吸光度值算
出磷含量，即可反映Vtg的含量(林浩然，刘晓春，2006)。

为使测定的吸光度在
有效范围内，血清稀释倍数200倍。

标准液为无水磷酸二氢钾(KH2PO4)。

1.5 数据处理
所有数据均采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，
用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，结果表示为平均值±标准差。

显著性差异
以P＜0.05表示差异显著;P＜0.01表示差异极显著。

2 结果
2.1 间苯二酚与邻苯二酚暴露泥鳅中毒症状
间苯二酚与邻苯二酚低质量浓度处理中(间苯二酚:5.287 mg/L，6.531 mg/L;邻苯二酚:16.708 mg/L，17.742 mg/L)，泥鳅行为无明显异常，未出现中毒或死亡现象。

高质量浓度处理中(间苯二酚:8.072 mg/L，10.000 mg/L;邻苯二酚:18.836 mg/L，20.000 mg/L)，第1周内泥鳅运动较为剧烈，7 d时游动开始减缓，反应迟钝，体表黏液增加;14 d时嘴角溃烂，鱼体略微灰白;28 d时基本不活动、不进食，体色变浅，体表出现白色斑点、出血点，局部皮肤溃烂。

2.2 间苯二酚与邻苯二酚对泥鳅血清Vtg水平的诱导
由表1可见，与对照组比较，泥鳅在低质量浓度间苯二酚(5.287 mg/L)中暴露7 d 时，血清Vtg水平即有极其显著升高(27.209 mg/L±0.019 mg/L)，并且随着暴露质量浓度的增加，血清Vtg水平逐渐升高，在高质量浓度(10.000 mg/L)中暴露7 d时，血清Vtg水平达到33.157 mg/L±0.062 mg/L。

由表2可见，与对照组相比较，泥鳅在低质量浓度邻苯二酚(16.708 mg/L)中暴露7 d时，血清Vtg水平也有极显著升高(21.201 mg/L±0.085 mg/L)，并且随着暴露质量浓度的增加，血清Vtg水平逐渐上升。

两种酚类化合物相比，暴露在间苯二酚中的泥鳅血清Vtg水平整体高于邻苯二酚。

表1 不同质量浓度间苯二酚对泥鳅血清Vtg诱导(Mean±SD)Table 1 Induction of serum Vtg of Misgurnus anguillicaudatus exposed in different mass concentration of m-dihydroxybenzene注:＊＊表示相同时间，各质量浓度与对照组中泥鳅血清Vtg水平差异极显著，P＜0.01;下表同Note:＊＊There are extremely significant differences between maximal mass concentration and control group at same time，P＜0.01;As same as the following table暴露时间Time(d)Vtg水平/(mg/L)Vtg levels of m 000 mg/L 7 0.019±0.001
27.209±0.019＊＊28.080±0.025＊＊29.854±0.101＊＊33.157±0.062-dihydroxybenzene 0.000 mg/L 5.287 mg/L 6.531 mg/L 8.072 mg/L 10.＊＊14 0.021±0.001 34.057±0.009＊＊ 30.667±0.041＊＊32.331±0.093＊＊
34.914±0.038＊＊21 0.021±0.003 34.078±0.027＊＊33.159±0.058＊＊
35.748±0.079＊＊37.473±0.061＊＊28 0.027±0.003 34.920±0.016＊＊
36.610±0.038＊＊38.323±0.053＊＊39.183±0.079＊＊
表2 不同质量浓度邻苯二酚对泥鳅血清Vtg的诱导(Mean±SD)Table 2 Induction of serum Vtg of Misgurnus anguillicaudatus exposed in different mass concentration of o-dihydroxybenzene暴露时间Time(d)Vtg水平
/(mg/L)Vtg levels of o 20.000 mg/L 7 0.018±0.001 21.201±0.085＊＊
22.058±0.045＊＊26.342±0.023＊＊28.058±0.047-dihydroxybenzene
0.000 mg/L 16.708 mg/L 17.742 mg/L 18.836 mg/L＊＊14 0.022±0.001
23.774±0.067＊＊24.627±0.029＊＊30.622±0.013＊＊32.334±0.029＊＊
21 0.024±0.002 31.476±0.032＊＊30.623±0.022＊＊35.764±0.075＊＊
37.472±0.059＊＊28 0.028±0.003 33.191±0.006＊＊34.905±0.034＊＊
39.186±0.021＊＊38.939±0.085＊＊
2.3 泥鳅血清Vtg水平与暴露时间的关系
由图1可见，在4个质量浓度间苯二酚处理组中，5.287 mg/L组泥鳅血清Vtg
水平在暴露14 d内升高较快，之后升高速度减缓;其它3个处理组(6.531 mg/L、8.072 mg/L、10.000 mg/L)泥鳅血清Vtg 水平随着暴露时间的延长(7 d、14 d、21 d、28 d)呈逐渐上升趋势。

由图2可见，16.708 mg/L邻苯二酚处理组泥鳅在暴露21 d内血清Vtg水平升高较快，之后趋于平缓，17.742 mg/L、18.836
mg/L和20.000 mg/L 3个邻苯二酚处理组的泥鳅血清Vtg水平均随暴露时间的
延长呈逐渐升高趋势。

2种化合物对泥鳅血清Vtg的诱导均呈现明显的时间-效应
关系。

3 讨论
图1 间苯二酚对泥鳅血清Vtg诱导的时间-效应关系Fig.1 Time-dependent response for serum Vtg induction in Misgurnus anguillicaudatus exposed
in m-dihydroxybenzene
图2 邻苯二酚对泥鳅血清Vtg诱导的时间-效应关系Fig.2 Time-dependent response for serum Vtg induction in Misgurnus anguillicaudatus exposed
in o-dihydroxybenzene
卵黄蛋白原含量与性类固醇激素之间存在密切关系(Reis-Henriques et al.，1997)。

由于雄性泥鳅自身内源性雌激素水平极低，所以其血清Vtg水平极低，甚至无法
检测到。

因此，雄性泥鳅血清Vtg水平的变化能够直接反映外源性雌激素物质的
暴露。

詹翠琼等(2007)对暴露在多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)中
的雄性孔雀鱼Vtg进行检测，发现PCBs可诱导其产生Vtg。

王宏元等(2011)通
过对雄性中国林蛙肝细胞雌激素受体和Vtg的检测，得出壬基酚对Vtg有明显的
诱导作用。

本研究中，暴露在间苯二酚与邻苯二酚中的雄性泥鳅血清Vtg水平升
高极其显著，说明2种酚类化合物可诱导雄性泥鳅肝脏合成Vtg，提示它们对雄
性泥鳅具有一定的环境雌激素效应。

赵岩等(2007)研究双酚A对雄性泥鳅血清Vtg的诱导作用时，发现血清Vtg含量随双酚A暴露时间和暴露浓度的增加而显著升高。

本研究对不同暴露浓度和暴露
时间雄性泥鳅的血清Vtg水平检测结果显示，随着间苯二酚和邻苯二酚暴露浓度
的增大，Vtg水平呈逐渐上升的趋势;在同一暴露浓度下，Vtg水平随暴露时间的
延长逐渐升高。

说明间苯二酚和邻苯二酚对雄性泥鳅血清Vtg的诱导作用与暴露
浓度和时间有密切关系，随着浓度的增大和时间的延长，诱导作用逐渐增强，提示2种酚类化合物对雄性泥鳅的环境雌激素效应会随着暴露剂量的增加和暴露时间的
延长而逐渐增强。

雷忻等(2012)在间苯二酚和邻苯二酚对泥鳅急性毒性效应变化规律的研究中，得出2种酚类化合物的毒性随着浓度的增大和时间的延长逐渐增强。

因此，间苯二酚和邻苯二酚对泥鳅的环境雌激素效应诱导变化规律与急性毒性效应变化规律相似，都存在剂量-效应和时间-效应关系。

低质量浓度间苯二酚(5.287 mg/L)暴露7 d时，血清Vtg水平为27.209
mg/L±0.019 mg/L，高质量浓度(10.000 mg/L)中暴露28 d时，血清Vtg水平达到39.183 mg/L±0.079 mg/L;低质量浓度邻苯二酚(16.708 mg/L)中暴露7 d 时，血清Vtg水平为21.201 mg/L±0.085 mg/L，高质量浓度(20.000 mg/L)中暴露28 d时，血清Vtg水平达到38.939 mg/L±0.085 mg/L。

比较间苯二酚和邻苯二酚诱导雄性泥鳅血清Vtg水平，前者均高于后者，说明间苯二酚对雄性泥鳅血清Vtg的诱导作用较邻苯二酚更为强烈。

Routledge和Sumpter(1997)、李高金等(2012)研究发现酚类化合物的雌激素活性与取代基的位置和结构有关，对于取代基结构相同的酚类化合物雌激素活性表现为间位酚＞邻位酚，本研究结果也符合这一规律，间苯二酚对水生生物的环境雌激素毒性效应大于邻苯二酚，在水环境污染的检测中应该引起高度重视。

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