水系统的采样及检测方法
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C.灭菌吸管取未稀释的水样和2—3个适宜稀释度的水样1ml，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
8.3菌落计数及报告方法
A.作为平皿计数时，可用眼镜直接观察，必要时用菌落计数器，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。求同稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状生长的菌落平板作为该稀释级的平均菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
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接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
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3
3
3
3
3
3
1
1
E.无菌操作，收集至少100ml水样。
F.取样后立即盖紧瓶盖。不要冲洗瓶子。
G.在瓶口留下足够的空间(至少2.5cm)，以利于检测前样品能充分摇动混合均匀。
H.关上采样阀。
6.保存时间和温度
6.1尽可能在取样后立即检测，以避免造成不可预料的微生物数量的改变，热水则应待其冷却至室温后检测。
6.2水样在低于10摄氏度条件下可以保存24小时。如保存超过24小时，则废弃样品重新取样。
—
513000
510000或5.1×105
6
27
11
5
—
270
270或2.7×102
7
多不可计
305
12
—
30500
31000或3.1×104
9.总大肠菌群法（多管发酵法）
9.1乳糖发酵试验
A.取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。
报告方式（CFU/mL）
10-1
10-2
10-3
1
1356
164
20
—
16400
16000或1.6×104
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
150
30
8
2
1500
1500或1.5×103
5
多不可计
1650
513
B.如果检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源中水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群9.A接种乳糖蛋白胨培养液在44.5℃±0.5℃水浴中培养，以下步骤同10.1.A。
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130
170
220
280
350
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1
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5
240
350
540
920
1600
＞1600
10.耐热大肠菌群(多管发酵法)
10.1检验步骤
A.自从大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中，置44.5℃水浴箱和隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24±2h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
5.2标记：记录样品编号，取样日期，取样点。
5.3直接从取样口的出口或管道的尾端或单支开口的取样阀取样
A.用70%酒精消毒采样口，尽可能消毒到内部。
B.放水冲洗采样口1-2分钟，冲洗时间应足够冲走消毒剂并排净不流动的水。
C.关小水流量，避免用采样瓶取水时水溅出。
D.到取样时才松开采样瓶口，勿接触瓶盖和内壁，直接取样。
9.2分离培养
A.将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝培养基平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h—24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深黑紫色、具有金属光泽的菌落
黑紫色、不带或略带金属光泽的菌落
淡紫红色、中心较深的菌落
B.B.证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱内，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
B.菌落总数的检验：水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48h后，所得每1mL水样中形成的微生物菌落总数。
C.大肠菌群的检验：在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
D.耐热大肠菌群的检验：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。
f菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可以用10的指数表示（见表1“报告方式”栏）。
表1稀释度选择及菌落总数报告方式
实例
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度
菌落数之比
菌落总数
（CFU/mL）
B.检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸毒吸管。
C.将接种管置于36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
4
16.0
5
﹥16
表3总大肠菌群MPN检索表
（总接种量55.5mL,其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样)
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
10
1
0.1
10
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3
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5
﹤2
2
4
5
7
9
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1
1
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32
38
44
50
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2
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70
94
120
150
180
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3
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33
39
45
52
39
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5
5
5
5
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3
3
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79
110
140
180
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250
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4
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4
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4
4
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4
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4
0
1
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3
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34
40
47
54
62
69
5
5
5
5
5
5
4
4
7.日常监测
日常监测计划应覆盖以下系统
A.原水：地下水
B.处理过的水
C.生活饮用水
抽样
频率
样品量
微生物指标
原水
1次/月
1样/点
菌落总数≤1000CFU/mL，大肠菌群≤3CFU/L
处理过的水
1次/周
1样/点
菌落总数≤100 CFU/mL，
大肠菌群（MPN/100mL）：不得检出
生活饮用水
1次/3月
1样/点
C.结果报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中总大肠菌群最可能（MPN）值，如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告大肠菌群未检出。
表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）
5个10mL管中阳性管数
最可能数（MPN）
0
﹤2.2
1
2.2
2
5.1
3
9.2
B.不同稀释度的选择及报告方法
a细菌宜选取平均菌落数在30-300之间者进行计算，若只有1个稀释度的平均菌落符合此范围，则将该稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
比值＝
b若有2个稀释级在30-300（30-100）之间时，则视二者之比值来决定。
当比值＜2时，应报告两者的平均数。
当比值≥2时，以报告稀释度较小的菌落数
3.材料
3.170%乙醇的喷壶
3.2无菌取样容器
3.3冰箱，温度设定为2℃~8℃
3.4培养箱
3.5菌落计数器
3.6试管
3.7电子天平，精确至0.1g
4.试剂/培养基
4.1营养琼脂
4.2乳糖蛋白胨培养液
4.3伊红美蓝培养基
4.4革兰氏染色液
4.5EC培养基
5.取样程序
5.1使用已灭菌的用玻璃瓶子，使用前应经过121度灭菌至少15分钟。
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0
0
0
05555 Nhomakorabea5
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10
8.3菌落计数及报告方法
A.作为平皿计数时，可用眼镜直接观察，必要时用菌落计数器，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。求同稀释度的平均数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状生长的菌落平板作为该稀释级的平均菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平皿后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
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24
28
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2
2
2
2
2
2
4
4
4
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
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5
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3
3
1
1
E.无菌操作，收集至少100ml水样。
F.取样后立即盖紧瓶盖。不要冲洗瓶子。
G.在瓶口留下足够的空间(至少2.5cm)，以利于检测前样品能充分摇动混合均匀。
H.关上采样阀。
6.保存时间和温度
6.1尽可能在取样后立即检测，以避免造成不可预料的微生物数量的改变，热水则应待其冷却至室温后检测。
6.2水样在低于10摄氏度条件下可以保存24小时。如保存超过24小时，则废弃样品重新取样。
—
513000
510000或5.1×105
6
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11
5
—
270
270或2.7×102
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多不可计
305
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—
30500
31000或3.1×104
9.总大肠菌群法（多管发酵法）
9.1乳糖发酵试验
A.取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1mL水样到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL（即0.1mL水样）注入到10mL单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。
报告方式（CFU/mL）
10-1
10-2
10-3
1
1356
164
20
—
16400
16000或1.6×104
2
2760
295
46
1.6
37750
38000或3.8×104
3
2890
271
60
2.2
27100
27000或2.7×104
4
150
30
8
2
1500
1500或1.5×103
5
多不可计
1650
513
B.如果检测未经氯化消毒的水，且只想检测耐热大肠菌群时，或调查水源中水的耐热大肠菌群污染时，可用直接多管耐热大肠菌群方法，即在第一步乳糖发酵试验时按总大肠菌群9.A接种乳糖蛋白胨培养液在44.5℃±0.5℃水浴中培养，以下步骤同10.1.A。
4
4
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220
280
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4
4
4
4
4
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
41
48
56
64
72
81
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
240
350
540
920
1600
＞1600
10.耐热大肠菌群(多管发酵法)
10.1检验步骤
A.自从大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管（产酸产气）中取1滴转种于EC培养基中，置44.5℃水浴箱和隔水式恒温培养箱内（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面），培养24±2h，凡平板上有典型菌落者，则证实为耐热大肠菌群阳性。
5.2标记：记录样品编号，取样日期，取样点。
5.3直接从取样口的出口或管道的尾端或单支开口的取样阀取样
A.用70%酒精消毒采样口，尽可能消毒到内部。
B.放水冲洗采样口1-2分钟，冲洗时间应足够冲走消毒剂并排净不流动的水。
C.关小水流量，避免用采样瓶取水时水溅出。
D.到取样时才松开采样瓶口，勿接触瓶盖和内壁，直接取样。
9.2分离培养
A.将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝培养基平板上，于36℃±1℃培养箱内培养18h—24h，观察菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
深黑紫色、具有金属光泽的菌落
黑紫色、不带或略带金属光泽的菌落
淡紫红色、中心较深的菌落
B.B.证实试验
经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃±1℃培养箱内，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
B.菌落总数的检验：水样在营养琼脂上有氧条件下37培养48h后，所得每1mL水样中形成的微生物菌落总数。
C.大肠菌群的检验：在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
D.耐热大肠菌群的检验：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为耐热大肠菌群。
f菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可以用10的指数表示（见表1“报告方式”栏）。
表1稀释度选择及菌落总数报告方式
实例
不同稀释度的平均菌落数
两个稀释度
菌落数之比
菌落总数
（CFU/mL）
B.检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.01mL甚至0.1，0.01，0.001mL，每稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸毒吸管。
C.将接种管置于36℃±1℃培养箱内，培养24h±2h,如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
4
16.0
5
﹥16
表3总大肠菌群MPN检索表
（总接种量55.5mL,其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样)
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
接种量/mL
总大肠菌群
（MPN/100 mL）
10
1
0.1
10
1
0.1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
﹤2
2
4
5
7
9
1
1
1
1
4
5
22
26
32
38
44
50
5
5
5
5
5
5
2
2
2
2
2
2
0
1
2
3
4
5
49
70
94
120
150
180
4
4
4
4
4
4
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
27
33
39
45
52
39
5
5
5
5
5
5
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
79
110
140
180
210
250
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
34
40
47
54
62
69
5
5
5
5
5
5
4
4
7.日常监测
日常监测计划应覆盖以下系统
A.原水：地下水
B.处理过的水
C.生活饮用水
抽样
频率
样品量
微生物指标
原水
1次/月
1样/点
菌落总数≤1000CFU/mL，大肠菌群≤3CFU/L
处理过的水
1次/周
1样/点
菌落总数≤100 CFU/mL，
大肠菌群（MPN/100mL）：不得检出
生活饮用水
1次/3月
1样/点
C.结果报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL水样中总大肠菌群最可能（MPN）值，如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告大肠菌群未检出。
表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数（MPN）
5个10mL管中阳性管数
最可能数（MPN）
0
﹤2.2
1
2.2
2
5.1
3
9.2
B.不同稀释度的选择及报告方法
a细菌宜选取平均菌落数在30-300之间者进行计算，若只有1个稀释度的平均菌落符合此范围，则将该稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
比值＝
b若有2个稀释级在30-300（30-100）之间时，则视二者之比值来决定。
当比值＜2时，应报告两者的平均数。
当比值≥2时，以报告稀释度较小的菌落数
3.材料
3.170%乙醇的喷壶
3.2无菌取样容器
3.3冰箱，温度设定为2℃~8℃
3.4培养箱
3.5菌落计数器
3.6试管
3.7电子天平，精确至0.1g
4.试剂/培养基
4.1营养琼脂
4.2乳糖蛋白胨培养液
4.3伊红美蓝培养基
4.4革兰氏染色液
4.5EC培养基
5.取样程序
5.1使用已灭菌的用玻璃瓶子，使用前应经过121度灭菌至少15分钟。
13
15
1
1
1
1
1
1
3
3
3
3
3
3
0
1
2
3
4
5
8
10
12
15
17
19
0
0
0
0
0
0
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
8
9
11
13
15
17
1
1
1
1
1
1
4
4
4
4
4
4
0
1
2
3
4
5
11
13
15
17
19
22
0
0
0
0
0
05555 Nhomakorabea5
5
0
1
2
3
4
5
9
11
13
15
17
19
1
1
1
1
1
1
5
5
5
5
5
5
0
1
2
3
4
5
13
15
17
19
22
24
1
1
0
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
2
4
6
8
10