基因分离的策略

基因分离的策略
一、概念
基因克隆是指通过分子生物学手段进行基因分离，从而进一步研究其结构功能。

分子克隆是指在体外对不同生物的DNA分子进行人工剪切，重新组合得到新的遗传物质通过载体转入到宿主菌或细胞中表达，扩增带目的基因的重组DNA。

基因克隆的目的是分离基因，分子克隆是分离基因的最终手段。

基因的分离是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。

由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组的很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、C、G四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。

二、基因克隆的总体策略
1、功能克隆法：依赖于基因表达产物及其生物功能进行基因克隆。

①通过分析蛋白质中氨基酸顺序合成寡核苷酸探针从cDNA文库中分离cDNA克隆
②通过制备基因产物单抗来进行cDNA片段分离
③通过构建cDNA的表达文库，利用基因产物的功能来筛选基因
2、定位克隆法：在事先不知道基因的相关功能信息的条件下，通过遗传连锁或细胞学定位技术将基因定位于染色体某一区段，再通过该区域的精细物理图或表达图分析、寻找候选基因并进行突变分析从而确定疾病的相关基因。

CpG岛筛选法、NotI连锁片段筛选法、外显子捕捉法和外显子扩增法、剪切位点筛选法、启动子捕捉法、polyA捕捉法、显微切割微克隆法、候选基因法。

3、消减杂交：将不同来源的基因组DNA或mRNA进行杂交，两者之间相同的核酸片段互补，或通过随机引物进行差别显示PCR扩增不同来源的cDNA，比较其中的mRNA表达差异，从而将两种之间的差异mRNA被筛选出来。

该法有两种思路：
①采用杂交的方法：消减文库、代表性差异显示、比较基因组错配筛选
② mRNA差别显示，采用PCR扩增，比较其mRNA的表达差异。

4、动物园杂交：利用一些基因在进化中高度保守的特点，在同种或不同种生物的基因组中有许多高度同源的基因，或具有共同的结构，因而可以利用已经有的基因与基因组文库或cDNA文库杂交，来调取高度同源、或结构相似、功能相似
的基因。

三、基因分离的主要研究方法
1、基因分离的物理化学方法：控制溶解使富含AT区解链变性，而富含GC区仍维持双链，当利用单链核酸酶S1酶去除解开的单链部分，得到富含GC区的片段。

2、鸟枪法：用生物化学方法，如用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上同一般基因大小相当的DNA片段，然后将这些片段混合物随机重组入适当的载体，转化后在受体菌中进行扩增，再用适当的方法筛选出目的基因。

3、 cDNA文库的构建与基因的分离
cDNA文库：同mRNA互补的DNA称为cDNA。

CDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA，即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA，称为cDNA。

选用合适的载体，将合成的cDNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。

cDNA文库特点：只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA的那些基因序列。

由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定的状态是由特定基因的表达所决定，因此各自的mRNA的种类不同，由此产生出独特的cDNA文库。

任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物全部编码基因。

一个cDNA文库的组建包括如下步骤：
①分离表达目的基因的组织和细胞：为了得到全长的cDNA，所用的材料要新鲜，要避免污染。

②从组织和细胞中制备总体RNA和mRNA：从有限量的起始材料去组建cDNA文库的主要限制是能否得到足够量的模板RNA。

所用的载体RNA与目的RNA一定有明显区别。

③第一条cDNA链的合成：分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的部分。

一般的mRNA都带有3`-polyA所以可用oligo(dT)作为引子开始第一条cDNA 链的合成。

如果mRNA不带3`-polyA，则必须先用大肠杆菌polyA聚合酶，在mRNA 的3`末端加上3`-polyA。

第一条cDNA链的合成需要RNA膜板、cDNA合成引物、反转录酶、4种脱氧核酸以及相应的缓冲液。

④第二条cDNA链的合成：先用碱将mRNA链除去，然后以第一条cDNA链为模板
合成第二条cDNA链。

由于第一条cDNA链3`-端往往形成一个钩子，所以，可以从这一点开始合成第二条cDNA链。

此反应由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ催化。

通常有三种方法：自身引导法：利用经一条链上的3`端序列的折回或发卡自引导法来合成。

该法效率低；cDNA第二条链的置换合成法：作为第一条链的cDNA:mRNA 杂交分子充当切口平移的模板，RnaseH在杂交分子上的mRNA链上造成切口或缺口，产生一系列RNA引物，他们被E.coli的DNA合成酶I用以合成第二条链。

该法效率高，直接利用第一条链反映产物，无需进一步处理和纯化，省去S1酶处理，改善了cDNA的质量；引物-衔接头法：通过将cDNA两端加上限制性内切酶位点，使其较方便的克隆入相应的载体。

⑤用核酸酶S1切去发夹形结构：S1酶专门切除单链DNA。

切除发夹形结构后，双链cDNA的分子大小需用变性琼脂糖凝胶电泳进行测定。

⑥ cDNA的甲基化和接头的加入：一旦双链cDNA被合成，可以用标准法将cDNA 甲基化和在其5`和3`端加上适当的接头。

当用有限材料制备时，甲基化这步可以省略，用预先切好的接头，这样就可以在不甲基化的条件下进行克隆。

接头除了提供相容的末端以便将cDNA进行克隆外，也可以作为双链cDNAPCR扩增引物位点。

⑦双链cDNA与载体的连接：双链cDNA与载体的有效连接是cDNA文库建立好坏的关键。

通常用λgt10/λgt11及与其相当的载体来组建非表达的cDNA文库，而一般不用转化效率较低的质粒作载体。