白藜芦醇对缺氧诱导神经元凋亡的影响

白藜芦醇对缺氧诱导神经元凋亡的影响
万晓梅;吴淑芳;魏楚蓉;伍吉云;高红英;徐悦青;魏慈照;李年秀;王俊宜
【摘要】目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对缺氧(hypoxia)诱导神经元凋亡的影响.方法:原代培养小鼠皮层神经元,置于2％ O2,5％ CO2和93％N2,37℃培养箱中培养12 h建立缺氧模型,采用DCFH-DA和显微荧光成像系统检测神经元活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量；碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和Hoechst 33342染色检测神经元凋亡.结果:RES预处理60 nin后再缺氧12
h,ROS含量和神经元凋亡率均显著低于缺氧组(P＜0.01,N=3),且使用1mM活性氧清除剂(N-acetyl-L-cysteine,NAC)也降低缺氧诱导的神经元凋亡率(P＜
0.01,N=6).结论:RES抑制缺氧诱导皮层神经元凋亡,此作用可能与RES抑制缺氧所致神经元ROS增多有关.
【期刊名称】《赣南医学院学报》
【年(卷),期】2013(033)003
【总页数】3页(P325-327)
【关键词】缺氧;白藜芦醇;凋亡;活性氧
【作者】万晓梅;吴淑芳;魏楚蓉;伍吉云;高红英;徐悦青;魏慈照;李年秀;王俊宜【作者单位】井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学附属医院妇产科;井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学神经退行性疾病与衰老研究中心;井冈山大学附属医院质控办;井冈山大学附属医院内科,江西吉安343000
【正文语种】中文
【中图分类】R965
缺氧在神经损伤中起着非常重要的作用。

研究表明，缺氧可引起神经元损伤，使胞体缩小，变形，细胞核固缩，碎裂，导致神经元数量减少[1]。

氧化应激是缺氧所
致神经损伤的重要机制之一[2]。

先前的研究表明，缺氧引起神经元活性氧含量升
高[3-4]。

过多的自由基引起脂质、蛋白质、核酸的过氧化，引起细胞凋亡。

白藜芦醇(Resveratrol，RES)是虎杖、葡萄中分离提取的一种非黄酮类多酚化合物，具有强抗氧化、清除自由基及抗脂质过氧化的作用[5]。

Hung等研究表明，白藜
芦醇能清除自由基，尤其是羟自由基，使DNA免受损伤[6]。

但关于白藜芦醇对
缺氧诱导神经元凋亡的影响研究尚少。

笔者对此进行了研究，现报告如下。

1 材料和方法
1.1 小鼠皮层神经元原代培养、纯度鉴定及缺氧处理皮层神经元原代培养参照文
献[5]，BALB/c小鼠购自中山大学医学院动物中心。

培养7天后，4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100透膜15 min，
10%BSA室温封闭1 h，β3-Tubulin抗体(Cell Signaling Technology)(1∶200)4℃孵育过夜，FITC标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶50)孵育1 h，Hoechst 33342复染细胞核5 min，激光共聚焦显微镜(SP5，Leica)拍照。

神经元纯度计算方法:绿色荧
光为神经元数量，蓝色核为细胞总数，计算百分比。

皮层神经元缺氧处理:神经元培养7天后，置于2%O2，5%CO2和93%N2，37 ℃ 培养箱中培养12 h，复制缺氧模型。

1.2 活性氧含量检测参照文献[5]，神经元处理后，加入5 μM活性氧 DCFH-DA
荧光探针避光37℃孵育50 min，PBS洗3次，显微荧光成像系统检测活性氧含
量。

1.3 神经元凋亡的检测神经元处理后，用5 μM碘化丙啶(Propidium Iodide，PI，激发波长535 nM，发射波长615 nM)和20 μg/mL Hoechst 33342避光孵育
30 min，PBS洗3次，共聚焦显微镜下观察，拍照。

红色为凋亡细胞，蓝色为总
细胞数，计算神经元凋亡率。

1.4 数据处理实验数据用均数±标准差(mean±SD)表示，经SPSS 13.0软件进行
统计分析，组间比较用one way ANOVA方法，P＜0.05为有统计学差异。

2 结果
2.1 小鼠皮层神经元形态及纯度镜下观察，皮层神经元胞体饱满，呈类圆形或梭形，胞核大且圆，突起长，相互形成稠密网络。

β3-Tubulin单克隆抗体以及FITC 标记的羊抗小鼠IgG二抗的显色结果:阳性反应物呈绿色荧光，分布于胞浆和突起。

Hoechst 33342染核呈蓝色荧光(见图1)，计算原代培养的皮层神经元纯度为(91.2±4.3)%。

2.2 白藜芦醇对缺氧诱导神经元活性氧含量变化的影响用25 μM RES预处理神经元60 min，再将海马神经元于2%O2、5%CO2、93%N237 ℃ 培养箱中缺氧处
理12 h，观察RES对缺氧时神经元活性氧含量变化的影响。

实验分 Control、25 μM RES、Hypoxia、25 μM RES+Hypoxia。

图1 皮层神经元形态及纯度用β3-Tubulin单克隆抗体孵育神经元，绿色荧光为阳性着色;Hoechst 33342蓝色荧光显示胞核。

实验重复三次
结果:缺氧处理12 h后，海马神经元DCF荧光值由 Control的(112.37 ±9.26)上
升至(187.19 ±20.43)(P ＜0.01，N=3);但用25 μM RES 预处理后再缺氧处理，DCF荧光值下降至(152.4±16.37)，与 Hypoxia组相比有显著差异(P ＜0.01，
N=3)，但仍高于 Control组(P ＜0.01，N=3)。

25 μM RES组 DCF 荧光值为(118.91 ±10.05)，与Control组相比没有统计学差异(P＞0.05，N=3)(见图2)。

上述结果表明，RES显著抑制缺氧诱导神经元活性氧含量的升高。

图2 RES对缺氧时神经元ROS含量变化的影响神经元培养7天后，用5 μM ROS 探针DCFH-DA孵育50 min，PBS液冲洗3次，采用CellR-MT 20显微荧光成像系统检测ROS含量。

* P ＜0.01，vs Control; † P ＜0.01，vs Hypoxia，N=3 2.3 白藜芦醇对缺氧诱导神经元凋亡的影响神经元用25 μM RES或1 mM NAC 预处理60 min后再缺氧 12 h，采用PI(5 μM)和Hoechst 33342(20 μg/mL)染色，激光共聚焦显微镜拍照。

结果表明，缺氧12 h，神经元凋亡率显著高于对照组(P＜0.01，N=6)，而RES或NAC预处理神经元60 min后再行缺氧处理，与缺氧组相比凋亡率显著降低(P＜0.01，N=6)。

单独使用RES或NAC处理，神经元凋亡率与对照组相比没有统计学差异(P＞0.05，N=6)(见图3)。

结合前面的数据显示，RES通过抑制缺氧所致活性氧的增多，从而减轻缺氧时神经元的凋亡。

图3 RES对缺氧诱导神经元凋亡的影响神经元用25 μM RES或1 mM NAC预处理60 min后再缺氧12 h，采用PI和Hoechst 33342染色，激光共聚焦显微镜拍照。

*P ＜0.01，vs Control;#P ＜0.01，vs Hypoxia，N=6
3 讨论
氧化应激损伤在脑缺血缺氧性神经损伤中起着关键作用。

生理条件下，体内氧自由基的产生和清除达到平衡。

当自由基产生过多和/或清除过少，在体内蓄积，攻击机体，产生氧化应激。

在缺血性脑损伤中，氧化应激不但直接损伤细胞，导致细胞坏死，而且通过介导线粒体途径、DNA修复酶及转录因子等引起细胞凋亡[7]。

大量研究发现，白藜芦醇减轻缺氧诱导的细胞凋亡[5，8-9]。

本实验数据也表明，白藜芦醇通过抑制活性氧含量的升高，减少缺氧所致的神经元凋亡，与上述研究结果相一致。

但其详细的机制有待于进一步探讨。

参考文献:
【相关文献】
[1]Wang Dong hong，Ling Shu cai.The progress of the effect of hypoxia in uterus on neurons and glial cells[J].Progress of anatomical sciences，2007，13(4):365-367.
[2]赵丹洋，吴伟康.氧化应激在脑缺血损伤中的作用机制[J].中国病理生理杂志，2004，20(4):679-82.
[3]Luo Y，Liu X，Zheng Q，et al.Hydrogen sulfide prevents hypoxia-induced apoptosis
via inhibition of an H2O2-activated calcium signaling pathway in mouse hippocampal neurons[J].Biochem Biophys Res Commun，2012，425(2):473-477.
[4]Lan AP，Xiao LC，Yang ZL，et al.Interaction between ROS and p38MAPK contributes
to chemical hypoxia-induced injuries in PC12 cells[J].Mol Med Rep，2012，5(1):250-255. [5]Agrawal M，Kumar V，Kashyap MP，et al.Ischemic insult induced apoptotic changes
in PC12 cells:protection by trans resveratrol[J].Eur J Pharmacol，2011，666(1-3):5-11. [6]Hung LM，Chen JK，Huang SS，et al.Cardioprotective effect of resveratrol，a natural antioxidant derived from grapes[J].Cardiovasc Res，2000，47(3):549-555.
[7]Wang CC，Fang KM，Yang CS，et al.Reactive oxygen species-induced cell death of rat primary astrocytes through mitochondria-mediated mechanism[J].J Cell Biochem，2009，107(5):933-43.
[8]刘丹妮，周秋兰，朱丹，等.白藜芦醇对缺氧诱导大鼠乳鼠心肌细胞凋亡的作用[J].医学研究杂志，2010，39(4):30-33.
[9]Chen CJ，Yu W，Fu YC，et al.Resveratrol protects cardiomyocytes from hypoxia-induced apoptosis through the SIRT1-FoxO1 pathway[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，378(3):389-393.。