核酶
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二、在其他领域的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）
10-23型脱氧核酶作用机理
deoxyribozyme
5
3
RNA substrate
R
YR
切割点
R=A or G Y=C or U
手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理
切割点
10
5‘ 3‘ C 3A‘
20
茎I(结合部位)
40
茎II (催化部位) 30
Ⅰ
3’ HO-G
GMP,GDP,GTP
p
p
5‘
类
Mg 2+或Mn 2+
内
P-G
含
3’ OH
p
子 的
剪
接
机
制
p
P-G
3‘
HO
外显子
内含子或居间序列 （Intervening sequence,IVS)
2‘
p
HO-A
5‘
p
套环的形成
Mg 2+
外显子连接
3’
p-A
OH
p
p
3 ‘
类 内
含
子
的
剪
接
机
制
P-A
起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。
剪切 位点
5 ‘
G U
J1/2
A
CG
GC
GC CG
Ⅰ
CG GC GU UG
G
G
G CAA C G
AU
J1/4 U A
UA
U
CG
CG
Ⅳ
GC AU
GC
GC
GC
GC
A C
U G
L4
c
GC
UA
CG
CG
AU
Ⅲ
CG GC
GC
U
U
C
C
GC
L3 C U
3 Ⅱ‘
A A G C G
❖ 剪接型核酶分类 ❖ 1、I类内含子
2、II类内含子
1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
❖ 剪接机制
❖ L-19IVS在体外的多种酶活性
❖ 核酶是一种金属依赖酶
❖ 结构与核苷酸序列
❖
5‘CUCUCU3’
❖
3’GGGAGG5’
❖ G结合位点:IVS 中的 P7茎区
3 ‘
前 体 3‘ 自 我 剪 接 反 G-IVS 应
rRNA
C C C U C U
O
o P OA +o
HOG
3’
C C C U C U O
o P OA o
OG
过渡态
C C C U C U
OH
+
o
Ao P-oG
o
C C C U C U O
o P OA o
OG
过渡态
C C C U C U O Mg 2+
三个碱基对的茎
需要二价阳离子，
产生5‘-OH和 2’,3’-环 磷酸
剪切部位
剪切部位
剪切机制
这类RNA进行自 身催化的反应是只切 不接。 特点：在 Mg 2+ 或其 他二价金属离子存在 下，在特定的位点， 自我剪切，产生5‘OH 和2’，3‘-环磷 酸二酯末端。
核酶自身剪切反应
mRNA剪接反应是 在剪接体（splicesome) 上进行的.
三个双螺旋区
13个核苷酸残基保 守序列
剪切反应在右上方 GUX序列的3‘端 自动发生
IVS
5
UCUAAA Pre-rRNA
‘
A
A
5‘
UCU A
GUAA GUAA
pGOH 5‘GAA
5‘
UCUoAH3’
GUAA
5
UCUUAA 3
‘
rRNA
‘
5’GAAA
GOH 3’
19nt L-19IVS
四 3膜 ‘虫
1、核酶抗肝炎病毒的研究
目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎 病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研 究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核 酶。
2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)核酶
1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶 抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。
RNaseP可剪切 前体5‘端41nt, 5’ 端成熟。不同 tRNA的 5’ 端没 有顺序共同性，剪 切的准确性与剪切 部位周围的核苷酸 顺序无关，表明在 RNaseP的组分内 没有引导序列， RNaseP所识别的 是底物的高级结构。
剪切位点
RNaseP底物的二级结构
1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
❖3、核酶作用的特点
❖ 化学本质 RNA ❖ 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 ❖ 反应特异性(专一性）碱基 ❖ 催化效率 低 ❖ 产物
4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
二、剪接型核酶
❖ 剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方 式除去内含子（Intron).
结构域Ⅴ：高度保守， 催化活性必需。
结构域Ⅵ：A 提供 2‘-OH
5 ’ 3’
Ⅱ类内含子二级结构模式
发夹二级结构模型
3 ‘5 5个环和4个螺旋形成两个 ‘ 结构域
剪切反应发生在底物识别 序列GUC的5‘端
两个内部环中的碱基及在 螺旋区Ⅱ的G11和底物中 的G+1都是酶发挥作用所 必需的。
剪切位点
HDV RNA斧头结构模式
HO 3’
Ⅱ
N50(DNA分子库） 5
‘
PCR
5 B‘ A
PCR
5
B
‘A
B
A
5 Streptavidin ‘
Column
cofactor
NaOH
B
A
体外选择技术筛选具有自我裂 解功能的DNA分子
引导序列
保守序列 G结合位点
剪接部位
Ⅰ类内含子二级结构通式
Ⅱ类内含子有一个保 守的二级结构：
结构域Ⅰ：两个保守 内含子结构序列 EBS1,EBS2与两个外 显子结构序列 IBS1,IBS2互相配对。
糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的 5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
体外： M1RNA具催化作用
蛋白质作为辅助因子
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
2、1剪切机制 Mg 2+
2、2结构与功能的关系 M1RNA 5‘端完 整结构对维持催化活性是必需的。
❖ 1、自身催化剪切型RNA
❖ 1、1 剪切机制
❖ 1、2 结构与功能的关系
❖
锤头结构 (Hammerhead)
❖
发夹结构(Hairpin)
❖
斧头结构(Axehead)
❖
假结样结构(Pseudoknot-like)
❖ 1、3 影响核酶活性的因素
2、异体催化剪切型RNA
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核
❖ 4、变形剂对活性的影响 ❖ 5、温度对活性的影响
在65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有 适宜的活性。
四、核酶的应用
一、在医学领域中的应用：
1. 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高， 专一性强。
2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割 肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目 的。
五、核酶技术面临的问题
1、核酶催化切割反应的可 逆性问题 2、提高催化效率 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶 细胞 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5、增强核酶在细胞内的稳定性 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察
o P OA o
Mg 2+ O G
金属离子催化
锤头（Hammerhead)结构
❖ 二级结构模型 ❖ 锤头二级结构编号 ❖ 锤头结构的类型 ❖ 锤头核酶的催化反应机制
锤头二级结构编号
17位（ X ）的核苷酸残 基多数是C,不能是U,G. 7位核苷酸残基的置换 不会对酶活性产生很大 影响
7位核苷酸
六、脱氧核酶的研究
1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子 脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体 上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已 有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。 2、脱氧核酶催化特征 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定 性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性
❖ 空间结构
核酶是一种金属依赖酶
❖ 金属离子的作用： ❖ 1、特异的结构作用，或参与活性部位的
化学过程 ❖ 2、促进RNA的总体折叠 ❖ 3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部
位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形 成
2、Ⅱ类内含子的自我剪接
❖ 剪接机制 ❖ 结构与功能的关系
三、剪切型核酶
第六章
核 酶（Ribozyme)
❖ 一、概述 ❖ 二、剪接型核酶 ❖ 三、剪切型核酶 ❖ 四、核酶的应用 ❖ 五、核酶技术面临的问题 ❖ 六、脱氧核酶（deoxyribozyme)
一、概 述
1、对酶及生物催化剂的认识的发展
生物催化剂 （Biocatalyst）
蛋白质类：天然酶 enzyme
极端酶 extremozyme
17位核苷酸
发夹（hairpin ）结构
❖ 发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草 环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。 三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链， 英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链 RNA。
❖ 发夹核酶结构模型 ❖ 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中
抗体酶 abzyme
生物工程酶 核酸类:
Ribozyme Deoxyribozyme
其它：模拟酶
克隆酶 遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、
2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生 物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分 子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。 1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间 26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年 证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984 年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有 该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无 酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得 1989年度诺贝尔化学奖。
J2/4
四个螺旋区，三个连接区，两 个环 活性中心区： J1/4, J2/4, L3 剪切位点：688/689
HDV 核酶假结样结构
影响核酶活性的因素
❖ 1、pH值对活性的影响 pH7﹒0 - 7 ﹒5 时核酶活性最高。
❖ 2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+ Mn
2+
❖ 3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应
5种snRNA 剪接体
50多蛋白质
mRNA剪接过程
锤头结构的 五种类型
R示酶，S示底物，箭头示剪切位点
建议的L19 RNA催化机理
锤头型核酶对切割位点的识别 位点遵守NHH规则（N代表任 意核苷酸，H代表A,U或C）。 催化过程需要二价金属离子参 与。
单金属离子催化
双金属离子催化
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用
CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性内切酶作用
CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN
核酶在医学上的应用
防治动、植物 病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链 的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变 核酶的克隆等
极强的切割特异性（单碱基错配即可大幅降低切割活性）
10-23型脱氧核酶作用机理
deoxyribozyme
5
3
RNA substrate
R
YR
切割点
R=A or G Y=C or U
手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理
切割点
10
5‘ 3‘ C 3A‘
20
茎I(结合部位)
40
茎II (催化部位) 30
Ⅰ
3’ HO-G
GMP,GDP,GTP
p
p
5‘
类
Mg 2+或Mn 2+
内
P-G
含
3’ OH
p
子 的
剪
接
机
制
p
P-G
3‘
HO
外显子
内含子或居间序列 （Intervening sequence,IVS)
2‘
p
HO-A
5‘
p
套环的形成
Mg 2+
外显子连接
3’
p-A
OH
p
p
3 ‘
类 内
含
子
的
剪
接
机
制
P-A
起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高。
剪切 位点
5 ‘
G U
J1/2
A
CG
GC
GC CG
Ⅰ
CG GC GU UG
G
G
G CAA C G
AU
J1/4 U A
UA
U
CG
CG
Ⅳ
GC AU
GC
GC
GC
GC
A C
U G
L4
c
GC
UA
CG
CG
AU
Ⅲ
CG GC
GC
U
U
C
C
GC
L3 C U
3 Ⅱ‘
A A G C G
❖ 剪接型核酶分类 ❖ 1、I类内含子
2、II类内含子
1. I类内含子的自我剪接(Self-splicing)
❖ 剪接机制
❖ L-19IVS在体外的多种酶活性
❖ 核酶是一种金属依赖酶
❖ 结构与核苷酸序列
❖
5‘CUCUCU3’
❖
3’GGGAGG5’
❖ G结合位点:IVS 中的 P7茎区
3 ‘
前 体 3‘ 自 我 剪 接 反 G-IVS 应
rRNA
C C C U C U
O
o P OA +o
HOG
3’
C C C U C U O
o P OA o
OG
过渡态
C C C U C U
OH
+
o
Ao P-oG
o
C C C U C U O
o P OA o
OG
过渡态
C C C U C U O Mg 2+
三个碱基对的茎
需要二价阳离子，
产生5‘-OH和 2’,3’-环 磷酸
剪切部位
剪切部位
剪切机制
这类RNA进行自 身催化的反应是只切 不接。 特点：在 Mg 2+ 或其 他二价金属离子存在 下，在特定的位点， 自我剪切，产生5‘OH 和2’，3‘-环磷 酸二酯末端。
核酶自身剪切反应
mRNA剪接反应是 在剪接体（splicesome) 上进行的.
三个双螺旋区
13个核苷酸残基保 守序列
剪切反应在右上方 GUX序列的3‘端 自动发生
IVS
5
UCUAAA Pre-rRNA
‘
A
A
5‘
UCU A
GUAA GUAA
pGOH 5‘GAA
5‘
UCUoAH3’
GUAA
5
UCUUAA 3
‘
rRNA
‘
5’GAAA
GOH 3’
19nt L-19IVS
四 3膜 ‘虫
1、核酶抗肝炎病毒的研究
目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎 病毒（ HBV）、丙型肝炎病毒（ HCV）以及HDV作用的研 究。人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核 酶。
2、抗人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)核酶
1998年，美国加利福尼亚大学Wong-Staal等利用发夹核酶 抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进入临床Ⅰ期。
RNaseP可剪切 前体5‘端41nt, 5’ 端成熟。不同 tRNA的 5’ 端没 有顺序共同性，剪 切的准确性与剪切 部位周围的核苷酸 顺序无关，表明在 RNaseP的组分内 没有引导序列， RNaseP所识别的 是底物的高级结构。
剪切位点
RNaseP底物的二级结构
1、转核苷酸作用 2CpCpCpCpC CpCpCpCpCpC +CpCpCpC
❖3、核酶作用的特点
❖ 化学本质 RNA ❖ 底物 RNA 肽键 ā-葡聚糖分支酶 ❖ 反应特异性(专一性）碱基 ❖ 催化效率 低 ❖ 产物
4.核酶的分类
锤头核酶
发夹核酶 剪切型核酶 丁型肝炎病毒（HDV)核酶
根据催化反应
RNaseP
I内含子
剪接型核酶 II内含子
二、剪接型核酶
❖ 剪接型核酶的作用机制是通过既剪有接的方 式除去内含子（Intron).
结构域Ⅴ：高度保守， 催化活性必需。
结构域Ⅵ：A 提供 2‘-OH
5 ’ 3’
Ⅱ类内含子二级结构模式
发夹二级结构模型
3 ‘5 5个环和4个螺旋形成两个 ‘ 结构域
剪切反应发生在底物识别 序列GUC的5‘端
两个内部环中的碱基及在 螺旋区Ⅱ的G11和底物中 的G+1都是酶发挥作用所 必需的。
剪切位点
HDV RNA斧头结构模式
HO 3’
Ⅱ
N50(DNA分子库） 5
‘
PCR
5 B‘ A
PCR
5
B
‘A
B
A
5 Streptavidin ‘
Column
cofactor
NaOH
B
A
体外选择技术筛选具有自我裂 解功能的DNA分子
引导序列
保守序列 G结合位点
剪接部位
Ⅰ类内含子二级结构通式
Ⅱ类内含子有一个保 守的二级结构：
结构域Ⅰ：两个保守 内含子结构序列 EBS1,EBS2与两个外 显子结构序列 IBS1,IBS2互相配对。
糖核蛋白体复合物，能剪切所有tRNA前体的 5‘端，除去多余的序列，形成3’-OH 和 5’磷酸末端。
RNaseP由M1RNA和蛋白质亚基组成。
体外： M1RNA具催化作用
蛋白质作为辅助因子
体内： M1RNA和蛋白质对酶活性都是必需的。
2、1剪切机制 Mg 2+
2、2结构与功能的关系 M1RNA 5‘端完 整结构对维持催化活性是必需的。
❖ 1、自身催化剪切型RNA
❖ 1、1 剪切机制
❖ 1、2 结构与功能的关系
❖
锤头结构 (Hammerhead)
❖
发夹结构(Hairpin)
❖
斧头结构(Axehead)
❖
假结样结构(Pseudoknot-like)
❖ 1、3 影响核酶活性的因素
2、异体催化剪切型RNA
核糖核酸酶P(RNaseP)是内切核酸酶，是核
❖ 4、变形剂对活性的影响 ❖ 5、温度对活性的影响
在65℃范围内随温度升高而增加，37 ℃时均有 适宜的活性。
四、核酶的应用
一、在医学领域中的应用：
1. 通过识别特定位点而抑制目标基因的表达，抑制效率高， 专一性强。
2. 免疫源性低，很少引起免疫反应。 3. 针对锤头核酶而言，催化结构域小，既可作为转基因表达产 物，也可以直接以人工合成的寡核苷酸形式在体内转运。
3、抗肿瘤治疗 核酶能在特定位点准确有效地识别和切割 肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目 的。
五、核酶技术面临的问题
1、核酶催化切割反应的可 逆性问题 2、提高催化效率 3、寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶 细胞 4、使核酶在细胞内有调控地高效表达 5、增强核酶在细胞内的稳定性 6、对宿主的损伤问题有待进一步考察
o P OA o
Mg 2+ O G
金属离子催化
锤头（Hammerhead)结构
❖ 二级结构模型 ❖ 锤头二级结构编号 ❖ 锤头结构的类型 ❖ 锤头核酶的催化反应机制
锤头二级结构编号
17位（ X ）的核苷酸残 基多数是C,不能是U,G. 7位核苷酸残基的置换 不会对酶活性产生很大 影响
7位核苷酸
六、脱氧核酶的研究
1、体外选择技术筛选脱氧核酶分子 脱氧核酶分子的体外选择是通过优先扩增事先固定在固相载体 上的具有自我裂解功能的活性分子来实现的。通过这一技术已 有两种具有RNA裂解活性的脱氧核酶被筛选出来。8-17，10-23。 2、脱氧核酶催化特征 10-23裂解位点为嘌呤、嘧啶连接 双链稳定性越高，酶活性越高 结合臂的长度影响酶催化转换性 RNA-DNA 比 RNA-RNA 稳定 性差。 对Mg 2+,Zn 2+,Ca 2+,Mn 2+有依赖性 组氨酸，精氨酸促进催化活性
❖ 空间结构
核酶是一种金属依赖酶
❖ 金属离子的作用： ❖ 1、特异的结构作用，或参与活性部位的
化学过程 ❖ 2、促进RNA的总体折叠 ❖ 3、二价金属离子（如Mg 2+ ）与底物活性部
位直接相互作用，参与过渡中间复合物的形 成
2、Ⅱ类内含子的自我剪接
❖ 剪接机制 ❖ 结构与功能的关系
三、剪切型核酶
第六章
核 酶（Ribozyme)
❖ 一、概述 ❖ 二、剪接型核酶 ❖ 三、剪切型核酶 ❖ 四、核酶的应用 ❖ 五、核酶技术面临的问题 ❖ 六、脱氧核酶（deoxyribozyme)
一、概 述
1、对酶及生物催化剂的认识的发展
生物催化剂 （Biocatalyst）
蛋白质类：天然酶 enzyme
极端酶 extremozyme
17位核苷酸
发夹（hairpin ）结构
❖ 发夹核酶发现于三种不同植物RNA病毒，即烟草 环点病毒，菊苣黄色斑点病毒型和筷子芥花叶病毒。 三种发夹核酶分别是这些RNA病毒卫星RNA的负链， 英文缩写分别是sTRSV,sCYMVT,sARMV,均为单链 RNA。
❖ 发夹核酶结构模型 ❖ 发夹核酶催化机制 金属离子在催化反应 中
抗体酶 abzyme
生物工程酶 核酸类:
Ribozyme Deoxyribozyme
其它：模拟酶
克隆酶 遗传修饰酶 蛋白质工程新酶 、
2、长期以来，人们认为只有某些蛋白质才有生 物催化功能。但近些年研究发现，某些RNA分 子也具有生物催化功能，被称为Ribozyme。 1982年Cech等发现四膜虫细胞大核期间 26SrRNA前体具有自我剪接功能，并于1986年 证明其内含子L-19IVS具有多种催化功能。1984 年Altman等发现RNaseP的核酸组分M1RNA具有 该酶的活性，而该酶的蛋白质部分C5蛋白并无 酶活性。Cech和Altman因发现Ribozyme而获得 1989年度诺贝尔化学奖。
J2/4
四个螺旋区，三个连接区，两 个环 活性中心区： J1/4, J2/4, L3 剪切位点：688/689
HDV 核酶假结样结构
影响核酶活性的因素
❖ 1、pH值对活性的影响 pH7﹒0 - 7 ﹒5 时核酶活性最高。
❖ 2、二价金属阳离子对活性的影响 Mg 2+ Mn
2+
❖ 3、抗生素对活性的影响 大多数为抑制效应
5种snRNA 剪接体
50多蛋白质
mRNA剪接过程
锤头结构的 五种类型
R示酶，S示底物，箭头示剪切位点
建议的L19 RNA催化机理
锤头型核酶对切割位点的识别 位点遵守NHH规则（N代表任 意核苷酸，H代表A,U或C）。 催化过程需要二价金属离子参 与。
单金属离子催化
双金属离子催化
锤头型核酶的二级结构 和空间立体结构示意图
2、水解作用 CpCpCpCpC CpCpCpC + pC
3、转磷酸作用 CpCpCpCpCpCp+UpCpU
CpCpCpCpCpC + UpCpUp 4、去磷酸作用
CpCpCpCpCp CpCpCpCpC +Pi 5、限制性内切酶作用
CpUpCpUpN +G CpUpCpU +GpN
核酶在医学上的应用