液体活检技术在肺癌治疗中的应用

·综述·液体活检技术在肺癌治疗中的应用
杨晓瑞1易善永2冯沛贝2赵玲2
【摘要】肺癌为全球肿瘤相关死亡的首要原因，分子靶向治疗药物为其治疗提供了新的选择，
然而分子靶向治疗应以必要的基因检测为指导。

传统的穿刺或组织活检技术依赖的基因检测，风险
大，不宜反复进行。

而液体活检以外周血、唾液等为样本，进行循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤核
苷酸（ctDNA）检测，具有创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效等优势，在肺癌的诊断
与分期、疗效与预后预测、转移与复发风险评估、肿瘤异质性与耐药性研究等方面具有重要应用前
景。

本文就近年来液体活检技术在肺癌领域的研究进展进行综述，并就CTC与ctDNA技术的优缺
点、互补性以及目前的局限性进行简要讨论。

【关键词】肺肿瘤；肿瘤细胞，循环；液体活检；循环肿瘤核苷酸
Research advance on liquid biopsy in lung cancer Yang Xiaorui1, Yi Shanyong2, Feng Peibei2, Zhao
Ling2. 1Department of Pharmaceutical, 2Department of Oncology, Zhengzhou Central Hospital Affiliated to
Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China
Corresponding author: Yi Shanyong, Email: yisy2001@
【Abstract】Lung cancer is the malignant disease with the highest rate in terms of incidence and
mortality in world. Targeted cancer therapy should be guided by necessary genetic testing, of which
materials were often obtained by puncture or tissue biopsy. Conventional tissue biopsy was limited by high
risk and can not be repeated frequently. Liquid biopsy replaces tissue samples with peripheral blood, saliva
and so on, circulating tumor cells (CTC) and circulating tumor DNA (ctDNA) could be detected, bearing
the advantages of non-invasion, resampling, real time reflecting, and so on. Liquid biopsy shows great
potential in the area of diagnosing and staging, curative effect and prognosis prediction, metastasis and
recurrence risk assessment, heterogeneity and drug resistance research of lung cancers. This study reviewed
recent progress of liquid biopsy applications on lung cancer in above mentioned aspects，and briefly
discussed the advantages, disadvantages of CTC or ctDNA as well as their current challenges.
【Key words】Lung neoplasms; Neoplastic cells, circulating; Liquid biopsy; CtDNA
液体活检即主要通过血液、尿液、唾液等标本，检测包括循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、外泌体、小分子RNA及长链非编码RNA 等协助癌症诊断的技术手段，主要分为CTC与ctDNA检测2种。

CTC是指能在肿瘤患者外周血中检测到、来源于实体肿瘤、逃离宿主免疫杀伤后存活的异质性肿瘤细胞[1]。

ctDNA为来源于凋亡或坏死的肿瘤细胞以及增殖活跃的肿瘤细胞能主动释放的DNA片段（0.18～21 kb）[2]。

大量研究表明，CTC与ctDNA检测在肺癌的诊断与分期、疗效与预后预测、转移与复发风险评估、肿瘤异质性与耐
DOI:10.3877/cma.j.issn.1674-0785.2017.09.033
作者单位：450000 郑州大学附属郑州中心医院药学部1，肿瘤内科2通信作者：易善永，Email: yisy2001@ 药性研究等方面具有广泛应用前景。

本文对CTC 与ctDNA为主的液体活检技术在肺癌临床应用以及二者的关系与局限性做简要综述。

一、液体活检在肺癌临床诊治中的应用
肺癌作为全球肿瘤相关死亡的首要原因，其治疗备受关注。

分子靶向药物，包括表皮生长因子受体抑制剂（EGFR-TKI）、间变淋巴瘤激酶抑制剂（ALK-TKI）等相继出现，为其治疗带来了新的选择。

然而靶向治疗是以存在相关的靶向变异为前提的。

迄今，肺癌基因突变检测在部分国家或地区已形成共识或规范。

美国国立综合癌症网络（NCCN）、欧洲临床肿瘤协会（ESMO）、美国临床肿瘤学会（ASCO）等组织协会均已发布治疗靶点分子检测的临床实践指南。

我国也于2015年达成非小细胞肺癌（NSCLC）患者EGFR基因突变检测专家共识[3]指导临床用药。

基因检测已成为肺癌个体化治疗的
决策基石。

传统基因突变检测依赖手术或穿刺等组织获取手段，技术要求较高，且均为有创操作，受制于肿瘤异质性难以提供有效的基因检测信息。

针对组织活检的种种局限，“液体活检”方法应运而生，且具有革命性的优势：创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。

1. 肺癌的早期诊断和临床分期：肺癌的早期诊断对治疗至关重要，为提高生存率的关键。

研究显示CTC与ctDNA对肺癌早期诊断具有潜在应用价值。

Chen等[4]采用靶向测序技术测试473例NSCLC 患者、227例肺部良性疾病与56名健康受试者外周血CTC水平，结果显示，NSCLC患者CTC水平显著高于肺部良性疾病与健康受试者（P＜0.001）。

相比于癌胚抗原、神经特异性烯醇、细胞角蛋白21-1，CTC表现更高的敏感度与专属性。

CTC联合癌胚抗原等指标诊断NSCLC更为有效。

此外该研究表明CTC水平与肿瘤分期密切相关，Ⅲ/ⅣNSCLC患者CTC水平高于Ⅰ/Ⅱ级患者。

Tanaka等[5]利用CellSearch™系统比较125例肺癌患者和25例肺部良性肿瘤患者的CTC阳性率，发现肺癌患者阳性率（30.6%）明显高于良性肿瘤患者阳性率（1
2.0%），并进一步发现肺癌患者外周血的CTC计数随肺癌分期的增加而显著增加，Ⅳ期患者CTC计数显著高于Ⅰ～Ⅲ期患者，有远处转移的患者CTC计数显著高于无转移的患者。

以上研究表明CTC对于肺癌诊断与分期具有指导意义。

ctDNA来源于肿瘤细胞的坏死和凋亡，与肿瘤组织DNA具有较好一致性，因此及时检测ctDNA 对于肺癌的诊断与分期也具有指导意义。

Chen等[6]通过靶向测序方法测定了58例早期NSCLC患者血浆与肿瘤组织DNA，确定了EGFR、KRAS、PIK3CA、TP53等常见驱动突变，结果显示外周血ctDNA监测与肿瘤组织DNA检测具有较好的一致性，证实了外周血ctDNA检测应用于NSCLC早期监测的可行性，且进一步表明ctDNA水平与肿瘤分期、亚型等临床特征密切相关。

Kumar等[7]测定了42例NSCLC患者3个化疗周期前后血浆ctDNA水平，发现各时期良性或疾病稳定期患者血浆ctDNA水平显著低于疾病进展期患者。

目前CTC与ctDNA在肺癌的早期诊断与分期应用中尚处于起步阶段，还需更多临床证据的支持，但其可作为影像学及病理学检查的有益补充，更准确地反映患者病情。

2. 疗效评价与预后判断：肺癌患者的疗效与预后和多种因素有关，大量研究结果表明液体活检技术在化疗疗效评价及预后判断方面具有重要作用。

目前肺癌化疗疗效评价主要通过常规影像学检查，而研究发现CTC数量与化疗后影像学应答存在相关性。

Wu等[8]应用CellSearch™系统对12例化疗2个周期的肺癌患者跟踪随访，发现CTC数量与化疗后影像学的应答存在相关性，提示CTC可实时监测肺癌患者化疗的疗效。

此外，CTC水平与患者预后具有较好相关性。

Hiltermann等[9]利用CellSearch™系统发现每7.5 ml血液中CTC数目＞215的患者中位生存期（157 d）明显低于CTC数目＜2的患者中位生存期（729 d），说明CTC数量可预测小细胞肺癌（SCLC）患者的生存期。

ctDNA与肿瘤进展具有良好的相关性，可以用于疗效监测与预后预测。

Imamura等[10]对52例EGFR突变阳性且首次给予EGFR-TKI治疗的肺腺癌患者治疗期间进行血液EGFR突变检测，同时采用CT扫描与RECIST评价标准评价疗效，结果患者血浆ctDNA水平与RECIST评价结果相吻合，表明ctDNA检测可评价EGFR-TKI治疗疗效。

Yang 等[11]对73例晚期肺腺癌患者EGFR-TKI治疗前后的血浆样本进行ctDNA检测，结果显示74%的样本ctDNA检测到EGFR突变，EGFR突变阳性患者相比于野生型患者有更好的预后，且EGFR高突变丰度（＞5.15%）的患者相比于低突变丰度患者（≤5.15%）呈现了更好的预后。

以上研究证实了ctDNA 检测可用于预测晚期肺腺癌患者生存期。

CTC与ctDNA对肺癌患者的疗效评价和预后预测具有较好的指示作用，可作为判断肺癌患者疗效与预后的潜在因子，与传统的影像学检查相比，更为早期、敏感，重复性较好。

3. 转移与复发风险评估：转移和复发是肺癌患者死亡的主要原因。

肿瘤的复发和转移主要通过淋巴及血液系统播散，虽然在外周血中检测到CTC 与ctDNA并不意味着一定存在转移灶，但转移的概率会大大增加。

研究显示CTC水平与肿瘤远处转移具有相关性。

Bayarri-Lara等[12]采用流式细胞仪对56例进行手术治疗的NSCLC患者，术前及术后1个月采集外周血进行CTC检测，结果表明术后CTC阳性率显著降低，术后高CTC水平提示高复发风险。

Maeda等[13]从采用流式细胞仪检测肺癌切除患者肺静脉中CD14+和CD204+表达水平，结果肺静脉CD14+ CD204+细胞水平与原发肿瘤基质中
CD204肿瘤相关自噬细胞相关，且CD14+CD204+细胞水平较高患者明显更易发展为早期复发。

因此CTC可早期预警疾病的转移复发，进而为选择合理的治疗方案提供依据，改善患者的预后。

ctDNA水平可能与肿瘤复发转移有关。

ctDNA 的发现可追溯至对循环游离DNA（cell-free circulating DNA，cfDNA）的早期研究中。

cfDNA是由机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA。

通过对cfDNA中肿瘤特异性的畸变（如肿瘤原癌基因和致癌基因突变、微卫星改变和DNA甲基化等）的识别，证实其为肿瘤细胞来源的cfDNA，即ctDNA，且与肿瘤细胞基因组信息相一致[2]。

穆原等[14]对行肺癌根治术的40例NSCLC患者术前及术后静脉血进行ctDNA定量检测发现：未复发患者，术后血浆ctDNA水平显著降低（P＜0.001），复发患者手术前后ctDNA水平无显著差异（P=0.131），表明术后1～2周测定血浆ctDNA可对NSCLC患者术后复发进行评估。

刘宏杰等[15]进一步报道肺癌发生复发转移时外周血ctDNA水平明显增高。

以上研究均发现CTC或ctDNA水平与肺癌的复发、转移均有很好的相关性，可用于肺癌复发转移的监测与风险评估。

4. 肿瘤异质性与耐药性研究：肺癌靶向治疗的部分患者可获得性耐药，肿瘤异质性为其重要原因。

同一肿瘤内部，原发灶和转移复发灶之间均存在异质性，传统手术或穿刺组织活检技术，已无法全面揭示肿瘤的生物学特征及其动态变化。

液体活检则能够可多次、按需、无创性采样检测，实时、动态监测肿瘤整体基因组信息，实时追踪肿瘤异质性与耐药性。

ctDNA直接反应肿瘤基因信息，其在肿瘤异质性研究中具有天然的优势。

Liang等[16]报道1例多发转移NSCLC患者，初始对EGFR-TKI 治疗有效，然而8个月后肝脏转移急剧进展加剧。

该患者外周血ctDNA多基因筛查发现ALK易位为肿瘤进展与耐药性的主要原因。

Taniguchi等[17]发现43.5%的患者在给予EGFR-TKI治疗后表现出耐药性，继而采用ctDNA检测该部分患者T790M突变，结果均为阳性。

以上表明ctDNA检测可以监控疾病进展以及耐药性的发生。

同ctDNA一样，CTC提取的DNA可以实时跟踪肿瘤基因变化、体现异质性与耐药性机制。

Maheswaran等[18]对EGFR-TKI治疗NSCLC患者CTC开展了EGFR突变监测，结果显示CTC中T790M 突变在64%的患者中检测到，这些患者表现出疾病进展。

Sundaresan等[19]对40例EGFR突变阳性然而EGFR⁃TKI治疗后癌症进展的患者，分别进行组织标本活检和CTC/ctDNA液体活检，结果显示组织活检、CTC与ctDNA检测T790M突变阳性率具较好一致性，且CTC/ctDNA监测具有更高灵敏性，能够更好地反映肿瘤遗传学的本质与全貌。

以上研究提示可利用ctDNA或CTC相关突变基因监测，评价肿瘤的异质性与检测耐药性的发生，根据靶向治疗相关基因谱的变化指导临床药物选择。

二、CTC与ctDNA的优缺点以及目前的局限性
CTC与ctDNA作为液体活检两种主要的技术手段，具有各自的优缺点，且具有一定的互补性[20]。

CTC依赖于分离富集手段，其敏感度相对较低，成本相对较高，但可以对完整的肿瘤细胞进行形态学观察，可以确定肿瘤表型与肿瘤细胞的脏器来源，可以进行肿瘤细胞培养、体内体外功能检测，也可以展开种间移植研究[21]。

不同于CTC检测，ctDNA 的检测无需捕获或富集步骤，相对技术难度较小，敏感度较高，且不受CTC表面分子的限制，能够反映所有病灶的平均水平，但在机体良性疾病或者炎症状态下容易受到正常细胞的DNA片段干扰，同时ctDNA不能进行功能测定，难以体现肿瘤基因片段的来源[22]。

CTC与ctDNA技术在敏感度、异质性、功能评价等方面存在较好的互补性，二者相结合有望提供更为详细的癌症进展信息，指导临床诊断与治疗。

如Punnoose等[23]报道ctDNA及CTC 检测与NSCLC的靶向治疗疗效的相关性，ctDNA 检测EGFR突变相比CTC更为灵敏，且与原位肿瘤的一致性更高，而CTC数量的减少更适宜用于快速评价疗效，可以互补应用与临床。

CTC与ctDNA作为新兴的检测方法，其技术发展有待完善，临床应用有待检验。

技术层面而言，CTC与ctDNA面临的主要问题均为技术的标准化，目前已报道大量的CTC与ctDNA检测方法，但对患者的准备、样本的采集、储藏、处理、检测方法均缺乏一致性，分析结果往往受前处理及检测方法影响，难以保障检测结果稳定可靠，导致假阴性或假阳性结果[24]。

同时，CTC与ctDNA检测经济成本较高，从获取样本到分析结果耗时较长，也在一定程度阻碍其临床应用。

此外，CTC与ctDNA检测结果用于临床，目前还缺乏广泛的大规模多中心的临床试验验证[25]。

目前CTC与ctDNA检测不能代替常规的影像学检查，相信随着肿瘤特异性标志
物的发现、检测手段敏感性与特异性的提高、临床更大样本量和更具说服力的研究以及统一的标准检测方法来增强其可信度和可实践性，液体活检将会获得重大的进展并广泛应用于临床实践[26]。

三、总结与展望
尽管液体活检临床应用仍处于探索阶段，但诸多研究表明CTC与ctDNA在肺癌的诊断和分期、疗效与预后评估、复发和转移风险评估、耐药性与肿瘤异质性研究中具有广阔应用前景，其进展日新月异、令人振奋。

继FDA于2014年批准CellSearch™系统应用于CTC检测后，首个NSCLC患者ctDNA 基因检测试剂盒cobasEGFR突变检测试剂盒v2于2016年6月8日经FDA批准应用临床。

未来液体活检技术必将推动肺癌精准靶向治疗的不断进步，实现从定性到定量、从静态到动态、从单基因到多基因检测的转变，为肺癌的诊断、分期、疗效与预后评价、肿瘤异质性与耐药性研究等方面发挥更大价值。

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（本文编辑：张志巍）
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