MPE双光子介绍
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多光子专用物镜——为优化多光子激发而设计
1) NA1.05:
2) FN27.5： 3) 2mm： 4)透过率： 5)盖玻片:
高分辨率，足够小的会聚焦点
充分收集散射荧光 长工作距离 从400nm-1000nm 校正环
6)光校对:
600-1000nm红外校对
2004 Katashi Ishihara
物镜根据盖片和标本厚度进行校准
permitted
2004 Katashi Ishihara
2P sample
1P normal sample
4mm & 8mm Special Objective + SCALEVIEW-A2 optimization
2004 Katashi Ishihara
Surface
Scale-view 处理的标本
在体鼠脑 xyzt
NIBS Dr. Luo Minmin Neuron & Science
IBP Dr. Liu Li / Wang Jinhui Science & JCS 2004 Katashi Ishihara
肾脏 (血管)
Mouse kidney. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin. FV1000-MPE XLPLN25XSVMP zoom 2X
About 400um depth is observed
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
26 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
心脏(血管)
Rat Heart. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin.
固定后未经冷冻处理
FV1000-MPE M system XLPLN25XSVMP
Imaging Area (Left Atria)
2004 Katashi Ishihara
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
上海中科院神经所 杜久林 仪器：Olympus FV1000 MPE
2004 Katashi Ishihara
斑马鱼发育 xyzt
FUCCI (S-green;G1-red), Miyawaki, 2008
2004 Katashi Ishihara
多光子局限：
1）飞秒脉冲激光器，一个时间段只能出一条谱线。 多色荧光需要分时间序列采集 或选择两种染料的中间波长，同时激发（串色）
一.背景: 为什么使用双光子?
2004 Katashi Ishihara
宽场照明显微镜和共聚焦图像比较
2004 Katashi Ishihara
• 单光子共聚焦存在的问题
• 扫描深度？？ 一般< 80um
• 光漂白？？
严重
• 空间定点光刺激？？
几乎整个Z轴都受光
2004 Katashi Ishihara
37 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
Thank you !!!
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
高密度光子发生的区域：物镜的焦点处 多光子激发只发生在物镜的焦点上，因 此激光只在空间的焦点汇聚,非焦点区 域由于光子密度不足以激发荧光，因此 不存在非焦面层的激发,所以不需要共 聚焦针孔，因而提高了荧光检测效率。
Dr. S.Sekine, Dr. T.Shimizu
Tokyo Women's Medical University
30 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
FV1000 (SPE) UPLNSAPO30XS
来自百度文库
能见约440um
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
29 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
红外飞秒脉冲激光器
超短脉冲激光 »将高强度激光在压缩在极短的时间（飞秒）内发射
2004 Katashi Ishihara
红外飞秒脉冲激光器
1.2
重复频率F
峰 值 功 率 Ppeak 平均功率Pave
1
0.8
光强 P
0.6
脉宽τ
0.4
0.2
0
时间 T
2004 Katashi Ishihara
专为多光子优化而设计的光学部件
2 photon excitation absorption
The head of Zebra fish 8 days embryo: Endoccapillary cells （EGFP） and blood cells (DsRed) Image data courtesy of: Director Naoki Mochizuki Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center
about half energy (=double frequency) absorb two photons at once >300kW
< 100mW 100fs
2004 Katashi Ishihara
发生双光子现象的必要条件！！ 极大量的光子（峰值功率高），
在极短的时间内（飞秒）
在极小的空间内（聚焦面积/体积） 同时到达
980nm 红外激光 脉冲
2004 Katashi Ishihara
1 photon
Excitation state
Excitation Light Excitation light
2 photon
Fluorescence
Fluorescence
Ground state
absorb one photon
2004 Katashi Ishihara
单光子 激光 扫描 共聚焦 显微镜 双光子 显微镜
2004 Katashi Ishihara
双光子优点：
1）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小； 2）长波长的光受散射影响较小容易穿透标本， 激发光可以穿透更深的标本；
3）只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 更适合用来观察厚标本、活细胞 或用来进行空间定点光漂白实验。
针孔 物理阻挡
随着观察深度的增加，荧光的散射会越来越严重 越深的地方，荧光信号越弱。
2004 Katashi Ishihara
共聚焦 扫描深度的问题
5
2004 Katashi Ishihara
双光子 单光子
2004 Katashi Ishihara
多光子的成像特点
单光子 多光子
488nm 可见激光 连续
2004 Katashi Ishihara
什么是飞秒 ?
飞秒是时间度量单位
1秒 = 103毫秒 = 106微秒 = 109纳秒 = 1012皮秒 = 1015飞秒
光速=30万公里/秒
赤道长度 4万公里
光速在1飞秒的时 间内，可以传播 0.3um 不到头发 丝的1/100
2004 Katashi Ishihara
血管发育xyt
清华大学 黄蕾 （截图）
2004 Katashi Ishihara
斑马鱼脑部的神经元与血管 活体斑马鱼样本，脑部的神经 元（绿色）以及为神经元供养 的血管（红色），可以清晰看 出脑部不同脑区结构（例如中 脑的视顶盖和胞体层）。明场 勾勒出活体斑马鱼的脑部构造。 双光子xyz成像叠加图。
目的一：保护标本 目的二：看得深
2004 Katashi Ishihara
更深小鼠活体成像
麻醉小鼠从皮质表层到海马的CA1 区的3D重构.
标本：
Thy1-YFP H-line 雄鼠(8 周大) 物镜： XLPLN25XWMP
1300um
20
Image data courtesy of: Katsuya Ozawa RIKEN Brain Science Institute The image was acquired at RIKEN BSI-Olympus Collaboration Center 2014/12/8 No data copy / No data transfer
YFP-H Adult Mouse (13W) Cerebral Cortex-Hippocampus
1mm 2mm White Matter 3mm CA1
Hippocampus 4mm CA3 5mm 6mm Thalamus 7mm
Image data courtesy of:Hiroshi Hama, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics RIKEN Brain2014/12/8 Science Institute
36 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
2004 Katashi Ishihara
小鼠肾脏在体 xyt
2004 Katashi Ishihara
定点诱导细胞死亡实验
中科院植物所
2004 Katashi Ishihara
胰脏 (血管)
Mouse Pancreas Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin.
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
2 photon excitation absorption
The head of Zebra fish 8 days embryo: Endoccapillary cells （EGFP） and blood cells (DsRed) Image data courtesy of: Director Naoki Mochizuki Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center
22
8mm
No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
在体小鼠免疫细胞迁移
Dr. Peace Xu, TSU
2004 Katashi Ishihara
清华大学祁海Nature文章
2004 Katashi Ishihara
1) NA1.05:
2) FN27.5： 3) 2mm： 4)透过率： 5)盖玻片:
高分辨率，足够小的会聚焦点
充分收集散射荧光 长工作距离 从400nm-1000nm 校正环
6)光校对:
600-1000nm红外校对
2004 Katashi Ishihara
物镜根据盖片和标本厚度进行校准
permitted
2004 Katashi Ishihara
2P sample
1P normal sample
4mm & 8mm Special Objective + SCALEVIEW-A2 optimization
2004 Katashi Ishihara
Surface
Scale-view 处理的标本
在体鼠脑 xyzt
NIBS Dr. Luo Minmin Neuron & Science
IBP Dr. Liu Li / Wang Jinhui Science & JCS 2004 Katashi Ishihara
肾脏 (血管)
Mouse kidney. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin. FV1000-MPE XLPLN25XSVMP zoom 2X
About 400um depth is observed
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
26 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
心脏(血管)
Rat Heart. Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin.
固定后未经冷冻处理
FV1000-MPE M system XLPLN25XSVMP
Imaging Area (Left Atria)
2004 Katashi Ishihara
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
上海中科院神经所 杜久林 仪器：Olympus FV1000 MPE
2004 Katashi Ishihara
斑马鱼发育 xyzt
FUCCI (S-green;G1-red), Miyawaki, 2008
2004 Katashi Ishihara
多光子局限：
1）飞秒脉冲激光器，一个时间段只能出一条谱线。 多色荧光需要分时间序列采集 或选择两种染料的中间波长，同时激发（串色）
一.背景: 为什么使用双光子?
2004 Katashi Ishihara
宽场照明显微镜和共聚焦图像比较
2004 Katashi Ishihara
• 单光子共聚焦存在的问题
• 扫描深度？？ 一般< 80um
• 光漂白？？
严重
• 空间定点光刺激？？
几乎整个Z轴都受光
2004 Katashi Ishihara
37 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
Thank you !!!
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
高密度光子发生的区域：物镜的焦点处 多光子激发只发生在物镜的焦点上，因 此激光只在空间的焦点汇聚,非焦点区 域由于光子密度不足以激发荧光，因此 不存在非焦面层的激发,所以不需要共 聚焦针孔，因而提高了荧光检测效率。
Dr. S.Sekine, Dr. T.Shimizu
Tokyo Women's Medical University
30 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
2004 Katashi Ishihara
FV1000 (SPE) UPLNSAPO30XS
来自百度文库
能见约440um
Hiroshi Hama, Rie Ito, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics, RIKEN Brain Science Institute
29 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
红外飞秒脉冲激光器
超短脉冲激光 »将高强度激光在压缩在极短的时间（飞秒）内发射
2004 Katashi Ishihara
红外飞秒脉冲激光器
1.2
重复频率F
峰 值 功 率 Ppeak 平均功率Pave
1
0.8
光强 P
0.6
脉宽τ
0.4
0.2
0
时间 T
2004 Katashi Ishihara
专为多光子优化而设计的光学部件
2 photon excitation absorption
The head of Zebra fish 8 days embryo: Endoccapillary cells （EGFP） and blood cells (DsRed) Image data courtesy of: Director Naoki Mochizuki Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center
about half energy (=double frequency) absorb two photons at once >300kW
< 100mW 100fs
2004 Katashi Ishihara
发生双光子现象的必要条件！！ 极大量的光子（峰值功率高），
在极短的时间内（飞秒）
在极小的空间内（聚焦面积/体积） 同时到达
980nm 红外激光 脉冲
2004 Katashi Ishihara
1 photon
Excitation state
Excitation Light Excitation light
2 photon
Fluorescence
Fluorescence
Ground state
absorb one photon
2004 Katashi Ishihara
单光子 激光 扫描 共聚焦 显微镜 双光子 显微镜
2004 Katashi Ishihara
双光子优点：
1）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小； 2）长波长的光受散射影响较小容易穿透标本， 激发光可以穿透更深的标本；
3）只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。 更适合用来观察厚标本、活细胞 或用来进行空间定点光漂白实验。
针孔 物理阻挡
随着观察深度的增加，荧光的散射会越来越严重 越深的地方，荧光信号越弱。
2004 Katashi Ishihara
共聚焦 扫描深度的问题
5
2004 Katashi Ishihara
双光子 单光子
2004 Katashi Ishihara
多光子的成像特点
单光子 多光子
488nm 可见激光 连续
2004 Katashi Ishihara
什么是飞秒 ?
飞秒是时间度量单位
1秒 = 103毫秒 = 106微秒 = 109纳秒 = 1012皮秒 = 1015飞秒
光速=30万公里/秒
赤道长度 4万公里
光速在1飞秒的时 间内，可以传播 0.3um 不到头发 丝的1/100
2004 Katashi Ishihara
血管发育xyt
清华大学 黄蕾 （截图）
2004 Katashi Ishihara
斑马鱼脑部的神经元与血管 活体斑马鱼样本，脑部的神经 元（绿色）以及为神经元供养 的血管（红色），可以清晰看 出脑部不同脑区结构（例如中 脑的视顶盖和胞体层）。明场 勾勒出活体斑马鱼的脑部构造。 双光子xyz成像叠加图。
目的一：保护标本 目的二：看得深
2004 Katashi Ishihara
更深小鼠活体成像
麻醉小鼠从皮质表层到海马的CA1 区的3D重构.
标本：
Thy1-YFP H-line 雄鼠(8 周大) 物镜： XLPLN25XWMP
1300um
20
Image data courtesy of: Katsuya Ozawa RIKEN Brain Science Institute The image was acquired at RIKEN BSI-Olympus Collaboration Center 2014/12/8 No data copy / No data transfer
YFP-H Adult Mouse (13W) Cerebral Cortex-Hippocampus
1mm 2mm White Matter 3mm CA1
Hippocampus 4mm CA3 5mm 6mm Thalamus 7mm
Image data courtesy of:Hiroshi Hama, Atsushi Miyawaki Laboratory for Cell Function Dynamics RIKEN Brain2014/12/8 Science Institute
36 2014/12/8 No data copy / No data transfer permitted
双光子同步多色
Single line image by 950nm
EGFP DsRed2
GFP
DsRed
Dual line sequential image by 940nm & 1040nm
2004 Katashi Ishihara
小鼠肾脏在体 xyt
2004 Katashi Ishihara
定点诱导细胞死亡实验
中科院植物所
2004 Katashi Ishihara
胰脏 (血管)
Mouse Pancreas Blood vessels labeled with Texas Red–labeled lectin.
800
850
900
950
1000
1050
1100
1150
1200
2 photon excitation absorption
The head of Zebra fish 8 days embryo: Endoccapillary cells （EGFP） and blood cells (DsRed) Image data courtesy of: Director Naoki Mochizuki Department of Cell Biology, National Cerebral and Cardiovascular Center
22
8mm
No data copy / No data transfer permitted
2004 Katashi Ishihara
在体小鼠免疫细胞迁移
Dr. Peace Xu, TSU
2004 Katashi Ishihara
清华大学祁海Nature文章
2004 Katashi Ishihara