菌种选育和保藏
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对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能 多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方 法的失败而导致菌种的丧失。
菌种选育和保藏
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT C
国立标准菌种保藏所，英国，伦敦
菌种选育和保藏
AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
CAF
中国林业科学院菌种保藏管理中 心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵工业科学研究 所
CMCCቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
医学微生物菌种保藏管理中心
ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所
冰箱中保藏。
菌种选育和保藏
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘 油的新配制液体培养基洗涤收获。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年 而活力不受影响。
菌种选育和保藏
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚 砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚 砜5％。
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
菌种选育和保藏
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷
冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果， 通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保 藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻 速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
菌种选育和保藏
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种选育和保藏
菌种保藏方法
暂时保藏法
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
菌种选育和保藏
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进 行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温
菌种选育和保藏
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度 达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相 (-156℃)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于 一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
菌种选育和保藏
2．控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大
的金属容器中； (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度
之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)； (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可
能快地发生相变；
所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最 好为过滤灭菌。
菌种选育和保藏
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘 油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体 细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
中国菌种保藏单位
缩写
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中 ACCC 心
ISF
中国农业科学院土壤肥料研究所
SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心
IA 中国医学科学院抗菌素研究所
SIA 四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中心 C
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所
或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长 适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰 箱中保存。
用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
菌种选育和保藏
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来 保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应 严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期 保藏。
菌种选育和保藏
(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡
混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打 散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃 安瓿用酒精喷灯封口； 将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和 悬浮培养基之间达到平衡。
菌种选育和保藏
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
菌种选育和保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试 管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度 范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。
菌种选育和保藏
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT C
国立标准菌种保藏所，英国，伦敦
菌种选育和保藏
AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
CAF
中国林业科学院菌种保藏管理中 心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵工业科学研究 所
CMCCቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
医学微生物菌种保藏管理中心
ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所
冰箱中保藏。
菌种选育和保藏
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘 油的新配制液体培养基洗涤收获。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年 而活力不受影响。
菌种选育和保藏
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚 砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚 砜5％。
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
菌种选育和保藏
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷
冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果， 通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保 藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻 速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
菌种选育和保藏
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种选育和保藏
菌种保藏方法
暂时保藏法
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
菌种选育和保藏
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进 行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温
菌种选育和保藏
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度 达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相 (-156℃)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于 一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
菌种选育和保藏
2．控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大
的金属容器中； (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度
之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)； (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可
能快地发生相变；
所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最 好为过滤灭菌。
菌种选育和保藏
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘 油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体 细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
中国菌种保藏单位
缩写
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中 ACCC 心
ISF
中国农业科学院土壤肥料研究所
SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心
IA 中国医学科学院抗菌素研究所
SIA 四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中心 C
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所
或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长 适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰 箱中保存。
用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
菌种选育和保藏
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来 保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应 严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期 保藏。
菌种选育和保藏
(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡
混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打 散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃 安瓿用酒精喷灯封口； 将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和 悬浮培养基之间达到平衡。
菌种选育和保藏
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
菌种选育和保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试 管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度 范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。