菌种选育和保藏
合集下载
微生物菌种的选育和保藏--诱变育种
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢诱变处理： ➢诱变剂的处理方式： ✔单因子处理：采用单一诱变剂处理出发菌株； ✔复合因子处理：两种以上诱变因子共同诱发菌体突变，包括①两种或多种 诱变剂先后使用；②同一种诱变剂的重复使用；③两种或多种诱变剂的同时使用。 ➢诱变剂的处理方法： ✔直接处理方法：将菌悬液用物理、化学因子处理，然后涂平板分离突变株； ✔生长过程处理法：适用于诱变作用强而杀菌率较低的诱变剂，或在分裂过 程中只对DNA起作用的诱变剂，如NTG、LiCl、 秋水仙碱等；方法：可将诱变剂 加入培养基后涂平板；或先把培养基制成平板，将一定浓度的诱变剂和菌体加入平 板； 或摇瓶振荡培养处理；
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 制备单孢子(或单细胞)悬液： ➢ 目的：获得单孢子(或单细胞)均匀的悬液；
➢ 原因: 分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落；
➢ 方法:✔菌龄:对数期细胞、刚成熟的孢子母菌细胞悬浮液的浓度为106个/mL、
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 突变株的分离与筛选： ➢ 筛选方案:
➢ 筛选方法： ✔初筛：a.随机筛选：也称摇瓶筛选；随机挑选的平板菌落进行摇瓶筛选； b.平板菌落预筛：在培养皿上诱变后从试样检出突变体的一种
琼脂平板筛选法,有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等; ✔复筛:对突变株的生产性能作比较精确的定量测定工作，代表方法：琼脂
放线 菌或细菌的浓度为108个/ mL左右;
✔菌悬液配制方法:离心洗涤前培养物，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬 液，放在盛有玻璃珠的三角瓶内振荡10min,令其分散，用无菌脱脂棉或滤纸过滤。 通过菌体计数，调整菌悬液的浓度供诱变处理。
四、诱变育种
2 诱变育种基本过程 ➢ 诱变处理： ➢ 诱变剂种类的选择：物理诱变剂和化学诱变剂 ✔物理诱变剂：紫外线、χ射线、γ射线、等离子、快中子、ɑ射线、β射线、 超声波等； ✔化学诱变剂: 碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等； ➢ 最适诱变剂量选择： ✔诱变剂剂量表示方式：a.UV的剂量指强度与作用时间的乘积； b.化学诱变剂剂量：诱变剂的浓度和作用 时间的乘 积来表示； c.在育种实践中，常以杀菌率来作诱变剂 的相对剂量； ✔最适诱变剂量确定：a.依据：最适剂量应该使所希望得到的突变株在存活 群体中占有最大的比例； b.方法：通过比较剂量--存活率曲线和剂量-
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
2. 通过寄主体进行复壮 3. 淘汰已衰退的个体
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
03微生物发酵菌种的选育与保藏
自发突变：在自然状况下发生的突变， 频率极低，对育种不利； 诱发突变：人为地用物理或化学因素诱 发的突变，突变率可以大大提高。可以 提高突变频率的物理或化学因素，称为 诱变因素或诱变剂。
1.3.2 诱变的基本原理 ★ 诱变剂作用机理 ★ 常用诱变剂
★诱变剂作用机理 微生物经诱变剂处理后，其遗传 物质可发生点突变和染色体畸变。
⑵通过目的代谢物产量的考察 在第一步初筛的基础上，对选出的 高产菌落进行复筛，进一步淘汰不良 菌株。
⑶进行遗传基因型纯度试验，以考察菌种 的纯度 将复筛后得到的高产菌种进行分离， 再次通过表观形态进行考察，分离后的菌 落类型愈பைடு நூலகம்，则表示纯度愈高，相似的主 要菌落(主型)占90％以上，表明其遗传基 因型分离少而较稳定。
1.3.1 突变 微生物的染色体上的遗传信息及染色 体组受到环境的作用而发生改变，这种 改变或多或少是永久性的。从生物表型 上说是突然发生的可遗传的变化，这种 变化就称为突变。带有这种变化的菌株 称为突变菌株。
★ 突变类型：
基因突变：只涉及少数核苷酸碱基的改 变，称为点突变或微小损伤； 染色体畸变（或染色体突变）：涉及一 大段核苷酸或染色体的突变。
◆快中子： 目前应用较好的诱变剂。中子不直接产生 电离，而从吸收中子的物质的原子核中 撞击出质子来，因而其生物学效应是由 质子造成的。 快中子比X射线和γ射线具有较大的电离 密度，因而能够更多地引起基因突变和 染色体畸变。
优良菌种
◇自然选择 ◇人工诱变 ◇原生质体融合 ◇基因工程育种 (1970s开始)
★菌种保藏: 由于微生物在传代过程中不断产 生变异，菌株选育获得的优良性状 不可能永久地保持下去，只能是使 这种退化速度尽可能减慢，就需要 创造适宜的环境来限制退化的速度。
生产中常用菌种的分离、选育和保藏
生产中常用菌种的分离、选育和保藏在生产中，分离、选育和保藏常用菌种是非常重要的步骤，这些菌种可以用于各种不同的应用，如发酵过程中的生物转化、抗生素的生产以及食品工业中的乳酸发酵等。
以下是常用菌种的分离、选育和保藏的基本步骤：1. 分离：分离菌种是指从自然环境中分离出纯种菌株的过程。
首先，需要选择合适的样品来源，如土壤、水样或食品样品等。
然后，将样品进行稀释、接种到固体培养基上，培养出菌落。
最后，从菌落中挑选单一菌株，并进行纯化培养，得到纯种菌株。
2. 选育：选育是指对已有菌种进行进一步培养和筛选，选出优良品系。
在选育过程中，可以根据所需特性进行筛选，如产量高、抗性强或代谢产物优良等。
通过连续传代培养和筛选，可以逐步培育出符合要求的优良品系。
3. 保藏：保藏是为了长期储存和保存已经分离和选育得到的菌种。
常用的保藏方法包括冷冻保存和冷冻干燥等。
冷冻保存是将菌种保存在低温 (-80℃或液氮温度下)，可以长期保存并保持菌株的生物学性状。
而冷冻干燥则是在低温下将菌种先冷冻，然后通过真空蒸发使其脱水，最后用密封容器保存。
冷冻干燥具有长期保存时间和较小的储存体积的优点。
在菌种的分离、选育和保藏过程中，需要注意的是严格遵守无菌操作规范，以防止杂菌污染。
另外，应该建立相应的菌种信息管理系统，记录并标注每个菌株的来源、特性以及保藏条件等重要信息，以便日后使用和查询。
菌种的分离、选育和保藏在生产中扮演着极其重要的角色。
下面将进一步探讨这些过程，并介绍一些常用的菌种及其应用领域。
在分离菌种的过程中，重要的是选择适当的样品来源。
不同的环境中存在着各种微生物，如土壤、水体、植物、动物及其制品等。
通过采集不同来源的样品，可以获得不同类型和特性的微生物，从而得到多样性的菌株资源。
在接种前，样品经过稀释，使微生物适当分散。
然后将稀释液均匀接种于固体培养基上，并进行孵育。
在培养过程中，微生物通过分裂繁殖形成菌落，而每个菌落代表一个菌株。
菌种的选育与保藏
菌种的选育与保藏微生物菌种选育与保藏本章知识概要第一节菌种分离与筛选第二节菌种选育第三节菌种保藏第一节菌种分离与筛选1、采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。
是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）②采样方法：选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、C：添加特殊抑制剂---抗生素3、纯种分离：富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养粗放型：菌落纯精细型：菌种纯划线分离法A：粗放型涂布分离法稀释分离法平板划线分离法：接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。
另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
菌种选育与保藏
3. 原生质体融合
4. 基因工程
二、菌种的保藏与复壮 1、菌种的退化
1）、菌种退化的原因
随着菌种保藏时间的延长或菌种的多 次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗 传性状可能得到延续，也可能发生变异。 变异有正变（自发突变）和负变两种。 菌种退化的主要原因是基因的负突变。
2）、菌种衰退的含义
菌种衰退（degeneration） 菌种衰退（degeneration）是指由于自 发突变的结果， 发突变的结果，而使某物种原有的一系列 生物学性状发生量变或质变的现象。 生物学性状发生量变或质变的现象。
种分离
通过纯种分离，可把退化菌种的细胞 群体中一部分仍保持原有典型性状的单细 胞分离出来，经过扩大培养，就可恢复原 菌株的典型性状。
2 ）. 通过宿主体内生长进行复壮 . 3）. 淘汰已衰退的个体
3、菌种的保藏
1）. 菌种保藏原理
菌种保藏的方法很多，原理也大 同小异。首先要挑选典型菌种的优良 纯种。最好采用它们的休眠体(如分生 孢子、芽孢等)；其次，还要创造一个 最有利休眠的环境条件，诸如干燥、 低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添 加保护剂或酸度中和剂等。
2）. 菌种保藏的方法
斜面低温保藏法 石蜡油封藏法 砂土管保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
回本章目录
3）. 影响菌种存活及长期保藏的 主要因素
（1） （2） （3） （4） （5） （6） （7） 培养条件和菌龄 菌种悬液的浓度 保护剂 冻结速度 干燥程度 保藏条件 恢复培养
第七节 菌种的选育与保藏
一、菌种的选育
1. 微生物菌种的筛选
要想使微生物产生大量的代谢产物， 可以通过选育突变株来实现。 包括营养缺陷型突变株；抗阻遏抗 反馈突变型和抗性突变型。
食用菌类栽培中的菌种培养和保藏技术
食用菌类栽培中的菌种培养和保藏技术食用菌作为珍贵的食材和药物，一直备受人们的喜爱。
在食用菌的栽培过程中，良好的菌种培养和保藏技术起着关键作用。
本文将讨论食用菌类栽培中的菌种培养和保藏技术，并提供一些相关的实用知识。
一、菌种培养技术1. 菌种选择在食用菌的栽培过程中，选择适宜的菌种至关重要。
良好的菌种具有以下特征：较高的产量和质量、抗病虫害性能较强、适应不同的栽培条件等。
因此，在菌种选择方面，我们应该综合考虑这些因素，选择最适合自己栽培需求的菌种。
2. 菌种的分离与培养菌种的分离与培养是培育优良菌种的基础。
一般来说，我们需要从菌体中分离出纯种菌株。
这个过程需要注意以下几点：首先，菌体取样要干净卫生，避免杂菌的污染；其次，在培养基的配置和操作中，要注意无菌操作，以确保分离出的菌株干净纯正。
3. 菌种的培养条件在培养菌种时，合理的培养条件能够提高菌种的生长速度和产量。
一般来说，食用菌类的培养条件包括温度、湿度、光照和通气等。
不同的菌种有不同的适宜培养条件，因此我们要根据不同的菌种来进行调控。
二、菌种保藏技术1. 冷冻保藏冷冻保藏是一种常见且有效的菌种保藏技术。
通常，菌种在低温条件下冷冻保存，可以长期保存。
在冷冻保藏过程中，我们需要注意以下几点：首先，保藏容器要干净无菌，以避免细菌和真菌的污染；其次，菌种的冷冻速度要快，以避免细胞组织的破坏；最后，冻存的菌种要存放在低温冷库中，以确保其质量和存活率。
2. 干燥保藏干燥保藏也是一种常用的菌种保藏技术。
在干燥保藏过程中，菌种通过将菌丝体或孢子在低湿环境下干燥，从而降低其新陈代谢和生化反应的速率。
干燥保藏的关键是要选择合适的保藏条件，包括温度、湿度和通风等。
3. 液氮冷冻保藏液氮冷冻保藏是一种高效的菌种保存技术。
液氮的极低温度可以有效地阻止细胞的生化反应和降解过程，从而保护菌种的完整性和活力。
在液氮冷冻保藏过程中，需要将菌种置于液氮罐中，并控制好保藏温度。
综上所述，食用菌类栽培中的菌种培养和保藏技术对于获得优质的食用菌产量起着至关重要的作用。
微生物菌种选育技术和保藏
琼脂（诊断灵敏度试验）
矿物盐、丙酸钠、硫胺素（M3 琼脂）
链霉菌，微单孢菌 马杜拉放线菌、小双孢菌、
链孢囊菌 诺卡氏菌
红球菌、小单孢菌
广泛应用的选择培养基。
①、几丁质培养基： 分离土壤和水中放线菌。 但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有
25％的菌种具有强的水解几丁质的能力。 许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌
接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离 出来。
方法的原理是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生 长或不利于其他菌型生长的条件。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。 但应注意的是，所需类型的菌种生长的结果有时 会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其 他微生物也能生长。通过把富集培养物接种到新 鲜的同一培养基可以重新建立选择压力。
菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗 传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质 和发展新品种，为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产 发展。所以，育种工作者要充分掌握微生物学、生物化学、 遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术，灵活而巧 妙地将其运用到育种中去，使菌种选育技术不断更新和发展。
用涂石蜡的棒置于碳源 培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
水、土壤、粪 肥
土壤、根土
水
海水、污泥 发霉的稻草
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
分离出的菌体
嗜粪红球、小单孢菌 属等
链霉菌属、马拉杜菌 属、小双孢菌属
小Байду номын сангаас孢菌属、内孢高 温放线菌 链霉菌属 嗜热放线菌
链霉菌属 链霉菌属
诺卡氏菌 游动放线菌属
矿物盐、丙酸钠、硫胺素（M3 琼脂）
链霉菌，微单孢菌 马杜拉放线菌、小双孢菌、
链孢囊菌 诺卡氏菌
红球菌、小单孢菌
广泛应用的选择培养基。
①、几丁质培养基： 分离土壤和水中放线菌。 但测试过的500株链霉菌和其他放线菌中，只有
25％的菌种具有强的水解几丁质的能力。 许多放线菌生长在能利用几丁质的可作为放线菌
接种已富集的培养物到固体培养基，可将优势微生物分离 出来。
方法的原理是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生 长或不利于其他菌型生长的条件。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
例如，供给特殊的基质或加入某些抑制剂。 但应注意的是，所需类型的菌种生长的结果有时 会改变培养基的性质，从而改变选择压力，使其 他微生物也能生长。通过把富集培养物接种到新 鲜的同一培养基可以重新建立选择压力。
菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗 传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质 和发展新品种，为生产不断地提供优良菌种，从而促进生产 发展。所以，育种工作者要充分掌握微生物学、生物化学、 遗传学的基本原理和国内外有关的先进科学技术，灵活而巧 妙地将其运用到育种中去，使菌种选育技术不断更新和发展。
用涂石蜡的棒置于碳源 培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
水、土壤、粪 肥
土壤、根土
水
海水、污泥 发霉的稻草
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
分离出的菌体
嗜粪红球、小单孢菌 属等
链霉菌属、马拉杜菌 属、小双孢菌属
小Байду номын сангаас孢菌属、内孢高 温放线菌 链霉菌属 嗜热放线菌
链霉菌属 链霉菌属
诺卡氏菌 游动放线菌属
食品发酵工程-2(微生物菌种的选育及保藏)
02
微生物菌种保藏
低温保藏法
总结词
通过降低温度来抑制微生物的生长和代谢，从而延长菌种保 藏时间。
详细描述
将微生物菌种保存在低温环境下，通常为-18℃至-70℃，可以 显著减缓菌种的生长和代谢速度，从而延长菌种保藏时间。低 温保藏法适用于大多数微生物菌种的长期保存。
干燥保藏法
总结词
通过去除水分来降低微生物的生存能 力，从而延长菌种保藏时间。
详细描述
将微生物菌种干燥至一定含水量，通常 为5%-10%，以降低菌种的生存能力。 干燥保藏法适用于耐干燥的微生物菌种， 如霉菌和酵母菌等。
冷冻真空干燥干燥保藏法
总结词
结合低温、干燥和真空条件来更有效地延长菌种保藏时间。
详细描述
在冷冻真空干燥机中，将微生物菌种在低温、真空条件下进行干燥处理，去除 水分，从而延长菌种保藏时间。冷冻真空干燥保藏法适用于对湿度敏感的微生 物菌种，如病毒和细菌等。
03
微生物菌种鉴定
形态学鉴定
总结词
通过观察微生物的形态、大小、颜色、生长速度等特征，初步判断微生物的种类。
详细描述
形态学鉴定是微生物鉴定的基础方法，通过显微观察，可以了解微生物的形态、大小、排列、运动性等特征，从 而判断其大致的分类。
生理生化鉴定
总结词
通过测定微生物对不同碳源、氮源、能源的利用以及产生的代谢产物，进一步确定微生物的种类。
详细描述
根据产物的性质选择合适的分离纯化方法，如离心、 过滤、萃取、沉淀等。通过实验确定最佳的工艺参数 和操作条件，以提高产物的纯度和收率。同时，可以 探索联合使用多种分离方法，以达到更好的分离效果 。
THANKS
感谢观看
的时间和较大的培养规模。
菌种选育和保藏
4℃冰箱存放。
菌种选育和保藏
矿物油中浸没保藏
将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保 藏，此方法简便有效。
可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特 别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基 上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
菌种选育和保藏
浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养 基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油， 矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会 加快。
菌种选育和保藏
当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利 于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。 而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加 入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。
建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养 基中。
菌种选育和保藏
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
菌种选育和保藏
矿物油中浸没保藏
将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保 藏，此方法简便有效。
可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特 别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基 上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
菌种选育和保藏
浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养 基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油， 矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会 加快。
菌种选育和保藏
当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利 于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。 而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加 入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。
建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养 基中。
菌种选育和保藏
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
三、 优良菌种选育,四菌种保藏的原理和方法
◆ 筛选检出抗药性突变株可用梯度培养皿法
温度敏感突变型筛选
TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant）
指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。
高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。 温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种
解除反馈阻遏
解除反馈抑制
通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过 抗结构类似物突变的方法筛选出来的 ◆ 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构 酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用； 但不能代替末端产物参与生物合成 ◆ 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可 合成末端产物
末端产物
许可温度(permissive temperature)
保持原来正常性状的温度
限制性温度(restrictive temperature〉 非许可温度 (non-permissive temperature)
显现突变型性状的温度
TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区 别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不 同。
1
自然选育
• 不经人工处理．利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为 自然选育（spontaneous mutation）：选育、定向培育 • 自然突变：多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应 • 多因素低剂量的诱变效应：指在自然环境中存在着低剂量的宇宙 射线、各种短波辐射、低剂量的诱变物质和微生物自身代谢产生 的诱变物质等的作用引起的突变。 • 互变异构效应：指四种碱基第六位上的酮基或氨基的瞬间变构， 会引起碱基的错配。引起自然突变的几率为10-8-10-9 • 自然突变的结果：一种是菌种退化；一种是对生产有益的突变
2 微生物的菌种选育和保藏
分钟，非芽孢菌迅速死亡，使芽孢杆菌的浓度得
到提高。
选择培养基
定义：是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群
体中分离出来的培养基。
方法：根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种
化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊
营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，
有利于所需微生物的生长。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养 需求设计的。如：
取内生菌的时候，先将植物根、茎或叶进行表 面消毒，然后切取的一小块（纵剖开），放入 培养基中培养。
3. 增殖培养
原因：采集到的样品，可能含有我们所需要的微生物， 但数量较少，而且杂菌混生，因而不易直接分离纯化， 需要增殖培养。 方法：往样品中加入适合某些微生物生长繁殖的物质， 或创造适合某些微生物生长繁殖的环境条件，这样就 促进了某些微生物的大量繁殖。
单细胞真核，含糖，偏酸，腐生，出芽繁 殖，假丝….
啤酒酵母----酿酒、细胞色素C、单细胞蛋 白、 甘油、琥珀酸
假丝酵母----面包、石油脱蜡、饲料
类酵母----脂肪酶
酵母菌
4. 霉菌
丝状真菌
生产菌种：根霉、毛霉、红曲霉、青霉等
产品：酶制剂、抗生素、有机酸、甾体激素
霉菌
其他生物：ຫໍສະໝຸດ A: 担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类
枯草芽孢杆菌---- 淀粉酶、蛋白酶
嗜热乳杆菌----乳酸 醋酸杆菌----醋酸 棒状杆菌----氨基酸 短杆菌----肌苷酸
质粒 (plasmid)：
定义：除核区 DNA外，还存在可进行自主复制的遗传
因子，称为质粒。
特点： (1)它是裸露的环状DNA分子，所含遗传信息量为2~200个基 因，能进行自我复制，有时能整合到核DNA中去。 (2)细菌可以失去质粒DNA而无妨于正常代谢活动。 (3)质粒DNA在遗传工程研究中很重要，常用作基因重组与 基因转移的载体。
到提高。
选择培养基
定义：是用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群
体中分离出来的培养基。
方法：根据不同种类微生物的特殊营养需求或对某种
化学物质的敏感性不同，在培养基中加入相应的特殊
营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，
有利于所需微生物的生长。
一种类型选择培养基是依据某些微生物的特殊营养 需求设计的。如：
取内生菌的时候，先将植物根、茎或叶进行表 面消毒，然后切取的一小块（纵剖开），放入 培养基中培养。
3. 增殖培养
原因：采集到的样品，可能含有我们所需要的微生物， 但数量较少，而且杂菌混生，因而不易直接分离纯化， 需要增殖培养。 方法：往样品中加入适合某些微生物生长繁殖的物质， 或创造适合某些微生物生长繁殖的环境条件，这样就 促进了某些微生物的大量繁殖。
单细胞真核，含糖，偏酸，腐生，出芽繁 殖，假丝….
啤酒酵母----酿酒、细胞色素C、单细胞蛋 白、 甘油、琥珀酸
假丝酵母----面包、石油脱蜡、饲料
类酵母----脂肪酶
酵母菌
4. 霉菌
丝状真菌
生产菌种：根霉、毛霉、红曲霉、青霉等
产品：酶制剂、抗生素、有机酸、甾体激素
霉菌
其他生物：ຫໍສະໝຸດ A: 担子菌：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类
枯草芽孢杆菌---- 淀粉酶、蛋白酶
嗜热乳杆菌----乳酸 醋酸杆菌----醋酸 棒状杆菌----氨基酸 短杆菌----肌苷酸
质粒 (plasmid)：
定义：除核区 DNA外，还存在可进行自主复制的遗传
因子，称为质粒。
特点： (1)它是裸露的环状DNA分子，所含遗传信息量为2~200个基 因，能进行自我复制，有时能整合到核DNA中去。 (2)细菌可以失去质粒DNA而无妨于正常代谢活动。 (3)质粒DNA在遗传工程研究中很重要，常用作基因重组与 基因转移的载体。
2第二章 菌种的选育、保藏和复壮
② 色素：对于产生色素的菌落，特别从有色变为白 色者，更要挑选出来，因为色素对于产品质量有关，避 免色素产生可以简化提炼过程。 ③生理生化：变异不容易直接辨认。实践中常采用 特别方法加以测定。例如在含有酪蛋白的培养基上，是 否有透明圈出现，以及透明圈大小可用来判断该菌是否 能产生蛋白酶以及酶活力的强弱。
左：MSA：可抑制葡萄球菌以外之菌的生长，发酵甘露 醇的葡萄球菌会使培养基变黃。
中：淀粉培养基：测定微生物是否具有淀粉酶。 右：血液培养基：用於测定微生物是否具有溶血性。
马康基氏培养基：可抑制革兰氏阳性菌生長，乳糖发酵 菌会生成红色菌落，非乳糖发酵菌則形成无色的菌落。
三酪脂琼脂培养基：测定微生物是否具有解脂酵素
④一次处理和分次处理的效果一样。但时间间隔 不能太久。5s+5s =10s ⑤具体操作：开灯预热20min(使光波稳定)→5mL 菌悬液→φ6cm培养皿→离灯30cm处→照射。 注意: a.培养皿底要平整并要摇动或利用磁力搅拌 设备，以求照射均匀。 b.对于有光复活作用的菌体,照射后须在红光 下操作。 c.处理后的菌悬液增殖培养期间，可用黑纸 包住平皿。
(一）诱变剂的种类
①物理诱变剂 射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子 ②化学诱变剂 碱基类似物、 5- 氟尿嘧啶、烷化剂、亚硝 基胍和甲基磺酸乙酯等。
化学诱变剂，比物理诱变剂电离辐射有效， 而且很很经济，但大部分诱变剂是致癌剂，危 害性大。
（二）诱变育种的基本步骤
1.基本步骤 •出发菌株的选择
胞系统内进行复制和表达的育种方法（又称
分子克隆）。
四、杂交育种
两个不同基因型的菌株通过结合或原生
质体融合遗传物质重新组合，在从中分离和
筛选初具有新性状菌株的育种方法
菌种选育培养及保藏
菌种的保藏
菌种的衰退和复壮
菌种的衰退概念：又叫做菌种的退化，是指生产菌种或者筛选出来的优良菌株，由于 进行接种传代或保藏之后，群体某些形态特征及生理特征逐渐减退或者完全丧失的现 象，这是一种群体概念。菌种退化过程是一个从量变到质变的过程。
自发突变
纯菌种
传代增殖
突变个体
原始个体
菌种为何会退化？
菌种的衰退和复壮
新菌种的一般分离筛选
菌种改良及工程菌构建
菌种改良概念、意义 菌种改良的理论基础 菌种改良的方式
一、菌种的选育
发酵工业常用微生物
工业常见微生物种类 工业生产对菌种的基本要求 工业菌种获取方式
新菌种的分离筛选方法
菌种改良及工程菌构建
菌种改良概念、意义 菌种改良的理论基础 菌种改良的方式
工业常见微生物种类
菌种的扩大培养
投入发酵生产前的扩大培养两阶段： 实验室种子制备、车间种子罐制备 实验室种子制备阶段： 孢子制备、摇瓶种子制备 生产车间种子罐制备阶段： 按照发酵罐大小，种子罐设置n级放大； 注意两参数种龄（对数中后期）和接 种量（细菌1%；霉菌10%）
二、菌种的扩大培养和保藏
菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮
菌Hale Waihona Puke 的保藏❖ 真空冷冻干燥法方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安瓿 管中→低温冻结（-18℃）→抽真空（至0.01 mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 ① 适用于各类微生物 ② 时间长达5年以上 优点：该法存活率高、不易变异 缺点：操作复杂、要求严格、需一定设备条件
本节课重点内容
➢工业常用的菌种有哪几类？ ➢工业菌种一般通过什么方式获取？ ➢菌种的一般分离纯化和筛选步骤是什么？ ➢菌种的选育方式有哪几种？ ➢菌种衰退的原因及复壮的方法是什么？ ➢常见的菌种保藏方式有哪几种？
菌种的衰退和复壮
菌种的衰退概念：又叫做菌种的退化，是指生产菌种或者筛选出来的优良菌株，由于 进行接种传代或保藏之后，群体某些形态特征及生理特征逐渐减退或者完全丧失的现 象，这是一种群体概念。菌种退化过程是一个从量变到质变的过程。
自发突变
纯菌种
传代增殖
突变个体
原始个体
菌种为何会退化？
菌种的衰退和复壮
新菌种的一般分离筛选
菌种改良及工程菌构建
菌种改良概念、意义 菌种改良的理论基础 菌种改良的方式
一、菌种的选育
发酵工业常用微生物
工业常见微生物种类 工业生产对菌种的基本要求 工业菌种获取方式
新菌种的分离筛选方法
菌种改良及工程菌构建
菌种改良概念、意义 菌种改良的理论基础 菌种改良的方式
工业常见微生物种类
菌种的扩大培养
投入发酵生产前的扩大培养两阶段： 实验室种子制备、车间种子罐制备 实验室种子制备阶段： 孢子制备、摇瓶种子制备 生产车间种子罐制备阶段： 按照发酵罐大小，种子罐设置n级放大； 注意两参数种龄（对数中后期）和接 种量（细菌1%；霉菌10%）
二、菌种的扩大培养和保藏
菌种的扩大培养 菌种的衰退与复壮
菌Hale Waihona Puke 的保藏❖ 真空冷冻干燥法方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安瓿 管中→低温冻结（-18℃）→抽真空（至0.01 mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 ① 适用于各类微生物 ② 时间长达5年以上 优点：该法存活率高、不易变异 缺点：操作复杂、要求严格、需一定设备条件
本节课重点内容
➢工业常用的菌种有哪几类？ ➢工业菌种一般通过什么方式获取？ ➢菌种的一般分离纯化和筛选步骤是什么？ ➢菌种的选育方式有哪几种？ ➢菌种衰退的原因及复壮的方法是什么？ ➢常见的菌种保藏方式有哪几种？
常用菌种的分离、选育和保藏
• 5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应 贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因 为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离 了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生 变化，微生物群体之间就会出现消长
1．土样采集方法
• 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层 顺序采集； • 水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆 筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面 5 ～ 15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻 璃瓶中。 • 在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢 慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约 20min，洗 去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根 部残留的土，这部分上却为根际土样。
•
•
次代培养及纯化步骤
1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布 不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落 对琼脂平板进行分类。 2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添 加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。 3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征 如色素、菌落形态等进行最初分组。 4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离 琼脂平板上进行筛选。
第三节
工业菌种的育种方针
• 工业菌种的育种： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定 生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通 过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不 良性质或增加新的性状。
工业菌种育种的方法
• 诱变 • 基因转移 • 基因重组
育种过程
• 包括下列3个步骤： • (1) 在不影响菌种活力的前提下，有益基因型 的引入。 • (2)希望基因型的选出。 • (3) 改良菌种的评价 ( 包括实验规模和工业生产 规模)。
放线菌的分离
• 土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎， 无菌海绵压印土样后压印平板后培养。 • 植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以 减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培 养。也可洗下微生物后振荡培养。 • 水中放线菌的分离： 为使所要分离的放线菌的数量 种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉 积或滤纸表面沉积进行系列稀释和涂布。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最 好为过滤灭菌。
菌种选育和保藏
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘 油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体 细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。
或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长 适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰 箱中保存。
用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
菌种选育和保藏
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来 保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应 严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期 保藏。
菌种选育和保藏
(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡
混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打 散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃 安瓿用酒精喷灯封口； 将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和 悬浮培养基之间达到平衡。
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
菌种选育和保藏
2．控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大
的金属容器中； (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度
之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)； (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可
能快地发生相变；
菌种选育和保藏
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度 达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相 (-156℃)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于 一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
菌种选育和保藏
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷
冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果， 通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保 藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻 速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能 多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方 法的失败而导致菌种的丧失。
菌种选育和保藏
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT C
国立标准菌种保藏所，英国，伦敦
菌种选育和保藏
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
菌种选育和保藏
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种选育和保藏
菌种保藏方法
暂时保藏法
中国菌种保藏单位
缩写
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中 ACCC 心
ISF
中国农业科学院土壤肥料研究所
SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心
IA 中国医学Байду номын сангаас学院抗菌素研究所
SIA 四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中心 C
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所
菌种选育和保藏
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
菌种选育和保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试 管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度 范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。
AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
CAF
中国林业科学院菌种保藏管理中 心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵工业科学研究 所
CMCC
医学微生物菌种保藏管理中心
ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所
冰箱中保藏。
菌种选育和保藏
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘 油的新配制液体培养基洗涤收获。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年 而活力不受影响。
菌种选育和保藏
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚 砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚 砜5％。
菌种选育和保藏
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进 行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温
菌种选育和保藏
(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤 1．待冷冻保藏菌种悬液的制备
(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10％甘 油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体 细胞悬液；0.5～lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶。
或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长 适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰 箱中保存。
用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。
菌种选育和保藏
应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来 保藏。
保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应 严格密封。
这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期 保藏。
菌种选育和保藏
(2)从浸没培养物制备菌悬液： 在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡
混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打 散； 0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃 安瓿用酒精喷灯封口； 将所有封好的安瓿置于5℃冰箱中3min，以使细胞和 悬浮培养基之间达到平衡。
菌种选育和保藏
一、微生物菌种保藏
基本要求：
在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
基本方法：
生活态
培养基传代培养 斜面、平板 寄主传代培养
休眠态
冷冻 干燥
菌种选育和保藏
液氮、低温冰箱 沙土管、冷冻真空干燥
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不 同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择 保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使 用特点及现有条件等进行综合考虑。
菌种选育和保藏
2．控速冷冻 (1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大
的金属容器中； (2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中； (3)以1-2℃/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度
之上几度的细胞冻结点(通常为-30℃)； (4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可
能快地发生相变；
菌种选育和保藏
(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1℃/min，直到温度 达-50℃；
(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或 气相 (-156℃)中保存。 如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于 一70℃冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。
斜面传代法 穿刺法
长期保藏法
液体石蜡法 甘油管法 砂管保藏法 砂土管保藏法 滤纸片保藏法 冷冻干燥保藏法 液氮冷冻法
菌种选育和保藏
2.1 冷冻保藏
冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。 通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷
冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果， 通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保 藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻 速度和解冻速变。 冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能 多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方 法的失败而导致菌种的丧失。
菌种选育和保藏
国际重要菌种保藏机构
缩写
名称
ATCC 美国标准菌种保藏所，美国马里兰州，罗克维尔市
CBS 真菌中心收藏所，荷兰，巴尔恩市
NCT C
国立标准菌种保藏所，英国，伦敦
菌种选育和保藏
第九节 工业微生物菌种保藏技术
在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某
一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保
藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。
菌种选育和保藏
一、理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在； (2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不
改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。 (3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心
CIVBP 中国兽医药品监察所
YM 云南省微生物研究所
菌种选育和保藏
二、工业微生物菌种保藏技术
(1)超低温或在液氮中冷冻保藏； (2)冷冻干燥或真空干燥保藏； (3) 转接培养或斜面传代保藏； (4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。
菌种选育和保藏
菌种保藏方法
暂时保藏法
中国菌种保藏单位
缩写
名称
缩写
名称
中国农业微生物菌种保藏管理中 ACCC 心
ISF
中国农业科学院土壤肥料研究所
SH 上海市农业科学院食用菌研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心
IA 中国医学Байду номын сангаас学院抗菌素研究所
SIA 四川抗菌素工业研究所
CCGM 普通微生物菌种保藏管理中心 C
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所
菌种选育和保藏
冷冻保藏种类
一、普通冷冻保藏技术(-20℃) 二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃) 三、液氮冷冻保藏技术
菌种选育和保藏
普通冷冻保藏技术(-20℃)
将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试 管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度 范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。
AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心
CAF
中国林业科学院菌种保藏管理中 心
CICC
工业微生物菌种保藏管理中心
IFFI
轻工业部食品发酵工业科学研究 所
CMCC
医学微生物菌种保藏管理中心
ID 中国医学科学院皮肤病研究所
NICPB 卫生部药品生物制品监察所
IV 中国医学科学院病毒研究所
冰箱中保藏。
菌种选育和保藏
如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘 油的新配制液体培养基洗涤收获。
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。 若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年 而活力不受影响。
菌种选育和保藏
三、液氮冷冻保藏技术
(一)冷冻保护剂
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚 砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚 砜5％。
菌种选育和保藏
二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80℃)
要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进 行保藏。
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是： 1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞； 2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜； 4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温