生化,分子,细胞试验汇总
《分子与细胞》实验
《分子与细胞》实验专题复习知识要点新兴县惠能中学李广梅实验一、检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质（必修一P18）还原性糖脂肪蛋白质材料苹果、梨花生种子黄豆或鸡蛋清试剂斐林试剂甲液:0．1g/ mL NaOH溶液乙液:0．05g/ mL CuSO4溶液（甲乙液混合用）苏丹Ⅲ或苏丹Ⅳ染液（显微镜观察）双缩脲试剂A液:0．1g/ mL NaOH溶液B液:0．01g/ mL CuSO4溶液（先加A液再加B液）结果（加热出现）砖红色沉淀橘黄色或红色紫色实验二：观察DNA、RNA在细胞中的分布（必修一P26）1．实验原理：甲基绿和吡罗红两种染色剂对DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使DNA 呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。
2．所用试剂及其作用：0．9%的NaCl溶液：保持细胞原有形态盐酸：能够改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，同时使染色休中的DNA和蛋白质分离，有利于DNA与染色剂结合。
3、过程：取口腔上皮细胞制片→水解→冲冼涂片→染色→观察(先低倍镜观察，找到目标后将其移至视野中央，调节清晰后换用高倍物镜观察)DNA RNA材料人的口腔上皮细胞试剂甲基绿吡罗红颜色绿色红色实验三：用高倍镜观察线粒体和叶绿体（必修一P47）1、实验原理：叶绿体的辨认依据：叶绿体是绿色的，呈扁平的椭圆球形或球形。
线粒体辨认依据：线粒体的形态多样，有短棒状、圆球状、线形、哑铃形等。
健那绿染液是专一性染线粒体的活细胞染料，可以使活细胞中线粒体呈现蓝绿色。
2、实验材料:藓类的叶、黑藻的叶（叶子薄而小，叶绿体清楚，可取整个小叶直接制片）3、过程：制片→低倍镜下找到叶片细胞→高倍镜下观察叶绿体的形态和分布制作人的口腔上皮细胞临时装片→观察线粒体4、实验结果线粒体叶绿体材料人的口腔上皮细胞藓类的叶、黑藻的叶试剂健那绿染液不需染色颜色蓝绿色（本身呈现）绿色实验四探究酵母菌的呼吸方式（必修一P91）1、实验原理：（1）酵母菌是一种单细胞真菌，在有氧和无氧的条件下都能生存，属于兼性厌氧菌，（2） CO2可使澄清石灰水变混浊，也可使溴麝香草酚蓝水溶液由蓝变绿再变黄。
普通生化实验总结
普通生化实验总结一、引言普通生化实验（General biochemistry experiments）是生物化学课程中的重要内容之一，通过实验操作和数据分析，帮助学生巩固理论知识，培养实验技能和科学思维能力。
本文将总结普通生化实验的主要内容，包括实验的目的、原理、实验操作步骤以及实验结果的分析和讨论。
二、实验目的普通生化实验的目的在于深入理解生物化学的基本原理和实验技术，培养学生的实验操作能力和数据分析能力。
三、实验一：蛋白质的定性实验1. 实验原理蛋白质是生物体内重要的有机物质，通过蛋白质的定性实验可以初步判断样品中是否含有蛋白质。
定性实验的原理是基于蛋白质的特性，在特定条件下，蛋白质与某些试剂发生反应产生显色或沉淀。
2. 实验操作步骤1.取一定量的样品溶液，分别加入Biuret试剂和Millon试剂，观察颜色变化。
2.根据颜色变化结果判断样品中是否含有蛋白质。
3. 实验结果分析根据实验结果，如果样品与Biuret试剂发生变色反应，由淡蓝变为紫色，可以初步判断样品中含有蛋白质；如果样品与Millon试剂发生变色反应，由白色变为红色，也可以确定样品中存在蛋白质。
四、实验二：酶的性质与活性测定1. 实验原理酶是生物体内的催化剂，能够加速生物化学反应的进行。
了解酶的性质和活性测定方法对于研究生物体内的代谢过程非常重要。
通过测定酶活性，可以确定酶对底物的催化效果和酶的活化或抑制情况。
2. 实验操作步骤1.准备一定浓度的酶底物和辅酶溶液。
2.将一定量的酶底物加入试管中，分别加入辅酶溶液。
分别设立对照组和实验组。
3.在一定时间内测量酶底物与辅酶溶液反应的光吸收度。
3. 实验结果分析通过测量实验组和对照组的光吸收度差异，可以计算出单位时间内的酶活性。
根据酶活性的测定结果，可以初步评估酶的催化效果和活性。
五、实验三：核酸的分离与纯化1. 实验原理核酸是生物体内的遗传物质，对于研究生物体的遗传信息和进化规律具有重要意义。
生化与分子生物实验
生物化学与分子生物学实验基本理论一、 分光光度技术利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计，这种分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外／可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
因此重点讨论紫外／可见分光光度技术的基本原理、仪器构造及其在生化领域中的应用等。
1．1基本原理光线是高速运动的光子流，也是具有波长和频率特征的电磁波。
光子的能量与频率成正比，与波长成反比。
肉眼可见的光线称为可见光。
可见光只占电磁波谱的很窄部分(400nm ～760nm)。
不同波长的可见光具有不同的颜色。
波长大于760nm 的光线称为红外线。
波长小于400nm 的光线称为紫外线。
当一束白光通过一杯有颜色的溶液时，具有一定波长的光线选择性的被溶液所吸收。
不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力不同，因此每种物质都具有其特异的吸收光谱。
吸收光谱的测定可以用来鉴定各种不同的物质。
例如核黄素之所以呈现黄色，是由于它仅吸收可见光中的蓝光范围，并测得其吸收峰在450nm （图3-1-1）。
（核黄素22 mol/L 溶于0.1mol/L 磷酸钠中， pH7.06，吸收杯厚1cm ）在紫外光范围它还有两个吸收峰。
它们分别是260nm 和370nm 。
分光光度法常被用来测定溶液中存在的光吸收物质的浓度。
其理论依据是郎伯—比尔(Lambert-Beer)定律。
（一）郎伯定律(Lambert’sLaw)一束单色光在通过一溶液时，由于溶液吸收一部分光能，使光的强度减弱。
若溶液的浓度不变，则溶液的厚度愈大，光强度的减弱也愈显著(图3-1-2)若I0表示入射光强度，I表示光线通过溶液后的强度，L表示溶液的厚度。
则－d I＝αI, －d I＝αI, 或d I＝αd L d L d L I积分：∫d I＝－∫αd L I得：InI=－αL＋C当Ｉ=0时，I=I0，所以C=InI0 ，即 InI=－αL＋InI0所以In I0＝αL 或I＝e-αL I I0或Log I0＝K1L (K=α),I＝10-K1L I 2.303 I0K1是一常数，受光线波长、溶液性质和溶液浓度影响。
常见的生物化学与分子生物学实验
一动物组织蛋白质得提取【目得要求】1掌握动物组织蛋白质得提取方法。
2了解动物组织蛋白质提取得原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多,性质上得差异很大,即或就是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同得体系中,因此不可能有一个固定得程序适用各类蛋白质得分离。
但多数分离工作中得关键部分基本手段还就是共同得,大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合得蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质.蛋白质在不同溶剂中溶解度得差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团得比例,其次取决于这些基团得排列与偶极矩。
故分子结构性质就是不同蛋白质溶解差异得内因.温度、ｐH、离子强度等就是影响蛋白质溶解度得外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来,并与其它不需要得物质分开。
但动物材料中得蛋白质有些以可溶性得形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离.蛋白质中得角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质,只需要适当得溶剂洗去可溶性得伴随物，如脂类、糖类以及其她可溶性蛋白质,最后剩下得就就是不溶性蛋白质.蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来,再用离心法除去不溶物即得粗提取液。
【试剂器材】1实验小鼠20、9ＮaCｌ3动物组织蛋白裂解缓冲液Ｔris 50ｍＭ，ＮａC1150mM ，ＥＤTA ０、5mM ，DTT 1mM ,TriｔoｎＸ—1001,去氧胆酸钠０、5,SDＳ0、14，PＭSF/异丙醇储备液100mM，174mg／1０mｌ于—20℃储存5－2０℃储存得冰块。
【操作步骤】1、颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取０、６g置于含预冷0、９NａＣ16mＬ得平皿中。
２、在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。
3、在预冷得裂解缓冲液中添加PMＳF／异丙醇储备液20?Ｌ／2mＬ。
各种诊断实验报告总结(3篇)
第1篇摘要：本报告总结了多种诊断实验的方法、原理、操作步骤及结果分析，旨在为临床诊断提供参考。
通过对实验数据的分析，探讨不同诊断实验在临床应用中的优势和局限性，为临床医生提供科学依据。
一、引言随着医学技术的不断发展，诊断实验在临床医学中扮演着越来越重要的角色。
通过实验，医生可以更加准确地了解患者的病情，为治疗方案的选择提供依据。
本报告将对各种诊断实验进行总结，包括生化实验、免疫学实验、微生物学实验、分子生物学实验等。
二、生化实验1. 实验方法：生化实验主要包括血液生化、尿液生化、肝肾功能检测等。
2. 实验原理：通过测定血液、尿液中的生化指标，了解患者体内的生化代谢状况。
3. 操作步骤：采集患者血液、尿液样本，按照实验要求进行检测。
4. 结果分析：根据实验结果，判断患者是否存在相关疾病。
三、免疫学实验1. 实验方法：免疫学实验主要包括血清学实验、细胞免疫实验等。
2. 实验原理：通过检测患者体内的抗体、细胞因子等免疫指标，了解患者免疫功能。
3. 操作步骤：采集患者血液样本，按照实验要求进行检测。
4. 结果分析：根据实验结果，判断患者是否存在免疫相关疾病。
四、微生物学实验1. 实验方法：微生物学实验主要包括细菌培养、抗生素敏感性实验等。
2. 实验原理：通过分离、培养、鉴定病原微生物，了解患者感染病原体。
3. 操作步骤：采集患者标本，按照实验要求进行分离、培养、鉴定。
4. 结果分析：根据实验结果，判断患者感染病原体种类，为抗生素选择提供依据。
五、分子生物学实验1. 实验方法：分子生物学实验主要包括PCR、基因测序等。
2. 实验原理：通过检测患者体内的特定基因、DNA序列，了解患者遗传病、肿瘤等疾病。
3. 操作步骤：采集患者标本，按照实验要求进行DNA提取、PCR扩增、基因测序等。
4. 结果分析：根据实验结果，判断患者是否存在相关疾病。
六、总结1. 优势与局限性：各种诊断实验在临床应用中具有各自的优势和局限性。
分子与细胞相关经典实验(解析版)
高中生物科学史经典实验复习专题1 分子与细胞实验1：分析细胞学说建立的过程一．细胞学说建立的过程答案：器官、组织、细胞、显微镜、动植物、细胞、细胞、新细胞、动物体、细胞分裂、分裂二．细胞学说知识框架答案：细胞、生物体结构、亲缘三．深化拓展提能细胞学说中2个“统一了”和4个“未涉及”四．澄清微点(1)细胞学说揭示了生物界的多样性和统一性，认为细胞一定都是由细胞分裂产生的。
( )(2)细胞学说不涉及原核细胞、真菌和病毒，仅涉及动物细胞、植物细胞。
( )(3)细胞学说的创立完全由施莱登和施旺完成。
( )(4)细胞学说认为细胞是一个有机体，一切生物体均由细胞组成。
( )答案：×、√、×、×五．巩固提升1．下列哪一项说法不符合细胞学说的主要内容（）A．生物都是由细胞构成的B．细胞是一个相对独立的单位C．新细胞都是老细胞产生的D．细胞的作用既有独立性又有整体性【答案】A【详解】A、细胞学说的主要内容之一是“动植物都是由细胞构成的”，并非所有的生物都由细胞构成，如病毒没有细胞结构，A错误；B、细胞学说表明细胞是一个相对独立的单位，B正确；C、细胞学说的主要内容之一是“新细胞可以从老细胞中产生”，C正确；D、细胞是一个相对独立的单位，既有它自己的生命，又对与其他细胞共同组成的整体的生命起作用，D正确。
故选A。
2．细胞学说建立于19世纪，是自然科学史上的一座丰碑。
下列关于细胞学说的叙述错误的是（）A．揭示了动植物细胞的统一性B．标志着生物学的研究进入了分子水平C．建立者主要是德国科学家施莱登和施旺D．显微镜技术的使用在细胞学说建立过程中发挥了重要作用【答案】B【详解】A、细胞学说指出细胞是一个有机体，一切动植物都是由细胞发育而来，细胞学说揭示了动物和植物细胞的统一性，A正确；B、细胞学说标志着生物学的研究进入了细胞水平，B错误。
C、细胞学说是由德国植物学家施莱登和动物学家施旺提出建立的，C正确；D、显微镜技术的使用，使人们认识到微观世界，使人类观察细胞成为可能，所以显微镜技术的使用在细胞学说建立过程中发挥了重要作用，D正确。
细胞分子相关实验报告
一、实验目的1. 了解细胞分子生物学的基本原理和实验技术；2. 掌握细胞提取、分子克隆、基因表达和蛋白质纯化等实验方法；3. 学习如何分析实验数据，提高科研能力。
二、实验原理细胞分子生物学是研究生物体内分子结构与功能相互关系的学科。
通过实验手段，我们可以了解基因表达调控、蛋白质合成与修饰、信号传导等分子生物学过程。
三、实验材料1. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、DNA提取试剂盒、PCR试剂、酶连接试剂等；2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、显微镜等；3. 实验样本：大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
四、实验步骤1. 细胞提取（1）将大肠杆菌或哺乳动物细胞在无菌条件下接种于培养皿中，培养至对数生长期；（2）用Tris-HCl缓冲液洗涤细胞，收集细胞；（3）加入细胞裂解液，冰浴破碎细胞；（4）4℃离心，收集细胞提取物。
2. 分子克隆（1）设计引物，进行PCR扩增目的基因；（2）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌；（3）筛选阳性克隆，提取质粒。
3. 基因表达（1）将目的基因克隆到表达载体中，转化哺乳动物细胞；（2）培养细胞，收集细胞提取物；（3）进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达。
4. 蛋白质纯化（1）将表达的目的蛋白进行亲和层析或离子交换层析；（2）收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
五、实验结果与分析1. 细胞提取：成功获得细胞提取物，可用于后续实验；2. 分子克隆：成功克隆目的基因，获得阳性克隆；3. 基因表达：目的蛋白在哺乳动物细胞中成功表达，SDS-PAGE电泳结果显示蛋白条带清晰；4. 蛋白质纯化：目的蛋白纯化效果良好，SDS-PAGE电泳结果显示蛋白条带单一。
六、实验讨论1. 细胞提取过程中，注意避免细胞裂解不充分或裂解过度；2. 分子克隆过程中，引物设计要合理，避免非特异性扩增；3. 基因表达过程中，优化培养条件，提高蛋白表达量；4. 蛋白质纯化过程中，选择合适的层析方法和洗脱条件，提高纯化效果。
细胞、生化及分子生物实验
生化及分子生物学大实验
班级生科1101 学号16 姓名雍婕实验1 RNA的提取及鉴定（综合）㈠实验目的1、学习和掌握提取RNA的原理和方法。
2、学习和掌握质粒RNA的鉴定方法。
㈡实验内容与基本要求1、RNA抽提：细胞和组织RNA的抽提按TRIzol TM操作程序。
组织RNA的提取：把小鼠的肝脏、骨骼肌和心肌等组织放到冰冻的碾钵中碾碎，加入适量的Trizol 试剂（1mL/100mg组织）裂解组织，冰上放置5 min。
吸入1.5mL离心管中，加入氯仿(0.2mL/mL Trizol)，冰上放置5 min。
10 000×g 离心10 min，吸取上清于另一离心管，加入等体积的异丙醇，室温放置10 min。
10 000×g离心15 min，去上清，70%乙醇洗涤沉淀，10 000×g离心2 min，去上清，室温风干，加DEPC处理的双蒸水溶解。
对提取的组织RNA进行鉴定：用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。
用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量。
电泳检测结果有三条清晰的rRNA 带：28S，18S和5S，表明RNA未降解。
㈢主要仪器设备及器材1、设备：低温离心机、恒温水浴器、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、恒温培养箱、高压灭菌锅、紫外线透射仪、液氮罐、陶瓷研钵、吸头、紫外分光光度计、PCR仪、电泳仪、水平式电泳槽、微量离心管。
2、试剂：TRIzol TM试剂、DEPC、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、溴化乙锭。
㈣试验结果与分析实验2 RT-PCR扩增获取目的基因（综合）㈠实验目的学习和掌握RT-PCR扩增的原理和方法。
㈡实验内容与基本要求1、RNA抽提及鉴定：组织RNA的抽提按TRIzol TM操作程序。
采用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。
2、RT-PCR扩增：采用两步法RT-PCR。
(1) 逆转录反应获得组织cDNA；(2) PCR反应，采用序列特异性引物（看家基因GAPDH或者β-actin），以组织cDNA为模板，进行PCR扩增。
生化分离实验总结
生化分离实验总结1. 引言生化分离实验是一种常用的实验方法，用于分离和纯化生物分子，如蛋白质、核酸等。
本文将总结生化分离实验的基本原理和常用方法，并介绍实验过程中可能遇到的问题及解决方法。
2. 基本原理生化分离实验的基本原理是利用样品中不同分子的物理性质差异，通过一系列分离步骤，将目标分子从其他组分中分离出来。
常见的生化分离方法包括离心、电泳、层析、过滤等。
•离心：利用样品中不同分子的密度差异，通过旋转离心机使分子沉淀或上漂。
•电泳：利用分子在电场中的迁移速度差异，将目标分子从复杂混合物中分离出来。
•层析：利用样品中不同分子在固相材料上的亲和力差异，通过流动相使分子在固相上进行逐步分离。
•过滤：利用膜孔大小的差异，通过过滤膜将目标分子分离出来。
3. 常用方法3.1 离心离心是一种常见的生化分离方法，适用于分离沉淀物和上清液。
实验需要使用离心机，操作步骤如下：1.将待分离的样品放入离心管中。
2.调整离心机参数，如离心速度、离心时间等。
3.开始离心，分离出沉淀物和上清液。
4.将上清液转移至新离心管中，即可得到纯净物质。
3.2 电泳电泳是一种基于分子在电场中的迁移速度差异进行分离的方法。
常见的电泳方法有蛋白质电泳、核酸电泳等。
操作步骤如下：1.准备电泳仪和电泳槽，加入凝胶和电泳缓冲液。
2.将待分离的样品与电泳缓冲液混合，加入电泳槽中。
3.设置电压和电泳时间，开始电泳。
4.根据目标分子的特性，通过观察凝胶上的条带来确定目标分子的位置。
5.切下目标条带，进行后续实验操作。
3.3 层析层析是一种利用物质在固相材料上的亲和力差异进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶过滤层析、离子交换层析等。
操作步骤如下：1.准备层析柱和流动相。
2.将待分离的样品与流动相混合，加入层析柱中。
3.通过缓慢加入流动相，使样品分子在柱中逐步分离。
4.收集目标分子的洗脱液，并进行后续实验操作。
3.4 过滤过滤是一种利用膜孔大小差异进行分离的方法，适用于分离固体颗粒、细胞等。
分子类细胞实验报告
一、实验目的1. 掌握分子类细胞实验的基本操作流程；2. 熟悉分子生物学实验常用仪器和试剂；3. 通过实验了解基因表达调控的基本原理；4. 分析实验结果，提高实验设计能力和数据分析能力。
二、实验原理基因表达调控是生物体生长发育、代谢和应激反应等生命活动中不可或缺的过程。
分子类细胞实验主要研究基因表达调控的分子机制，包括转录、转录后修饰、翻译和翻译后修饰等环节。
本实验通过构建基因表达载体，将其导入细胞中，观察目的基因在细胞中的表达情况，从而了解基因表达调控的基本原理。
三、实验材料1. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、细胞培养箱、移液器、显微镜等；2. 试剂：DNA模板、PCR引物、Taq酶、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒载体、转染试剂、细胞培养试剂等；3. 细胞：哺乳动物细胞系（如HeLa细胞）。
四、实验步骤1. 设计PCR引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度在20-30bp之间，保证退火温度在55-65℃之间。
2. PCR扩增目的基因：将DNA模板、PCR引物、Taq酶等加入PCR反应体系中，进行PCR扩增。
3. 限制性内切酶酶切：将PCR产物与限制性内切酶进行酶切反应，得到具有粘性末端的DNA片段。
4. DNA连接：将质粒载体与酶切后的目的基因进行连接反应，构建基因表达载体。
5. 转染细胞：将构建好的基因表达载体转染到哺乳动物细胞系中，常用的转染方法有脂质体转染、电穿孔转染等。
6. 细胞培养：转染后的细胞在细胞培养箱中进行培养，观察细胞生长状况。
7. 基因表达检测：通过Western blot、RT-qPCR等方法检测目的基因在细胞中的表达情况。
8. 数据分析：对实验结果进行统计分析，得出结论。
五、实验结果与分析1. PCR扩增：成功扩增出目的基因片段，片段长度与预期相符。
2. DNA连接：成功构建基因表达载体，电泳结果显示目的基因与质粒载体连接。
3. 转染细胞：转染后的细胞生长状况良好，未出现明显细胞毒性。
生化与分子生物学实验生化部分
本实验酶活测定具体注意事项
1. 安全：硫酸. 枪头、试管等严禁乱甩，乱放。防止烧伤 2. 安全：爱护分光光度计，及时擦洗仪器内的任何贱出和
外溢，
3. 安全：随时清理实验台面上的溢出及废纸。 4. 比色皿处理：反应液有限，不能润洗，测量时选择样
品浓度由低到高进行。 每个样品之间将比色皿倒扣在吸水 纸上，轻磕即可。
超声：高频，震动，能量 功 率：功率大，破碎效果好，产热高，蛋白变性多
一般原则：间歇超声，超声数秒钟，停数秒钟，循环多次 超声的必要条件：冰水浴，保证最佳的冷却状态。
冰水浴液面略高于样品液面 超声探头的位置： 位于样品液面下～1cm 我们的超声条件：功率180W, 超声 2 秒， 间歇 2 秒
循环次数：～500－700次 (视样品多少调整） 纯超声时间：1000－1400秒 （～17min)
2. 准确计时，并量取各种试剂： 在进行一组反应时，先设计各试剂加量及加入时间，
并用表格列出。严格按设计操作，减少人为误差。 3. 分光光度计测量反应液的OD560 ：
一次读数后，应将反应液倒回试管中，以备复查。 数据分析无误后才能丢弃。 4. 光吸收OD560读数应在分光光度计测量的有效范围内（即： 读数与浓度呈线形关系）
收菌
洗菌
破碎
收菌、洗菌
• 将全部培养液分两次离心后，全部集中 于1个离心管中，用STE充分悬浮（震荡 或枪吹打）。再离心后悬浮于15ml破碎 缓冲液（冷）用于破碎。
• 准备好要破碎的同学请带样品到339 房间 用french press 破碎细胞。带一个250ml的 烧杯，用于冰浴破碎后的样品。
细胞的超声波破碎
不正确的超声：探头接近液面，引起液面剧烈波动，产生大 量泡沫———蛋白变性 探头接近样品底部，超声效果差
生化,分子,细胞试验汇总
15.测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。
16.
17.根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase说明书。
18.
19.连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。
20)
21)当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。
22)
RT-PCR
1)根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。
15)以同样的方法再用700ul Buffer W2洗涤一次，12,000×g离心1min。
16)
17)将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备膜中央加25-30ul Eluent Buffer，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。
18)
感受态细胞的制备
1.准备LB培养基和LB平板。
10)
11)弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500rcf，5min.
12)
13)弃上清，等RNA干燥透明后加入30ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1%凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80℃冰箱保存。
14)
基因克隆
1.查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。
生物化学与分子生物学实验
标准蛋白溶液 (250µg/ml) -0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
待测管 （7 ）
—
待测血清
蒸馏水 试剂甲
—
1.0 3.0
—
—
—
—
—
0
1.0
-3.0
0.8 0.6 0.4 0.2
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
生物化学与分子生物学实验
生物化学与分子生物学
实验教学课件
1
生物化学与分子生物学实验
实验一： 基本操作与分光光度计的使用 实验二： 蛋白质的两性反应与等电点测定 实验三： 福林—酚试剂法测定血清总蛋白 实验四： 凝胶过滤分离高铁血红蛋白与高铁氰化钾 实验五： 蔗糖酶与淀粉酶的专一性 实验六： 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质 实验七： 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 实验八： 酵母RNA的提取及成分鉴定（浓盐法） 实验九： 葡萄糖氧化酶法测定血清葡萄糖 实验十： 聚合酶链式反应(PCR) 实验十一： 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验十二： 微量快速质粒DNA的提取与纯化
生物化学与分子生物学实验
预 习
实验三
福林—酚试剂法测定血清总蛋白
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生物化学与分子生物学实验
实
验
三
福林—酚试剂法测定血清总蛋白
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生物化学与分子生物学实验
实验目的
学习测定蛋白酶活力的方法 掌握分光光度计的原理和使用 方法
生物化学与分子生物学实验
实验原理
蛋白质浓度测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法
比色皿的使用方法
拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面， 不要碰比色皿的透光面，以免沾污
生化及分子生物学大实验
实验20质粒DNA的提取与鉴定实验21RNA的提取与鉴定教学内容提要与时间分配：1、实验原理讲解： 12分钟➢总RNA的提取真核细胞质总RNA主要由rRNA〔80-85%〕、tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA〔1-5%〕组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细胞质中。
完整RNA的提取和纯化，是进展RNA方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA别离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成与体外翻译等的前提。
所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即１〕样品细胞或组织的有效破碎；２〕有效地使核蛋白复合体变性；３〕对内源RNA酶的有效抑制；４〕有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中别离；5〕对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA酶活性。
RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径，1)提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；2)直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相，而RNA留在水相。
➢紫外分光光度法测定总RNA浓度与纯度鉴定核酸分子中的碱基含有共轭双键，具有一定的紫外吸收特性，其最大吸收峰的波长为260nm。
另外，核酸分子在双链向单链形式转化过程中，紫外吸收增加，故单链DNA与RNA分子较双链DNA分子具有更高的紫外吸收能力。
这些物理特性为测定核酸样品浓度提供了根底。
在波长为260nm，光程为1cm，A260＝1时，相当于双链DNA浓度为50μg/mL，单链DNA 或RNA为40μg/mL，单链核苷酸为20μg/mL。
紫外分光光度法可用于测定浓度大于0.25μg/mL的核酸浓度。
分光光度法不但能测定核酸浓度，还可通过测定在260nm和280nm的紫外吸收比值〔A260 / A280〕估计核酸的纯度。
纯洁的DNA样品的A260 / A280为1.8，纯洁的RNA制品的A260 / A280为2.0。
DNA样品中存在将导致比值升高，而比值降低说明有蛋白质或苯酚等污染。
常见的生物化学与分子生物学实验
一动物组织蛋白质的提取【目的要求】1掌握动物组织蛋白质的提取方法。
2了解动物组织蛋白质提取的原理。
【实验原理】由于蛋白质种类很多，性质上的差异很大，即或是同类蛋白质因选用材料不同使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。
但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。
因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质。
蛋白质在不同溶剂中溶解度的差异主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。
故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。
温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。
提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用将细胞内蛋白质提取出来，并与其它不需要的物质分开。
但动物材料中的蛋白质有些以可溶性的形式存在于体液如血浆、消化液等中可以不必经过提取直接进行分离。
蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。
蛋白质经细胞破碎后用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物即得粗提取液。
【试剂器材】1实验小鼠20.9NaCl3动物组织蛋白裂解缓冲液Tris 50mM，NaC1150mM ，EDTA 0.5mM ，DTT 1mM ，Triton X-1001，去氧胆酸钠0.5，SDS 0.14，PMSF/异丙醇储备液100mM，174mg/10ml于-20℃储存5-20℃储存的冰块。
【操作步骤】1.颈椎脱白处死小鼠75酒精擦拭皮肤剪开腹部剪切肝脏组织称取0.6g置于含预冷0.9NaC16mL的平皿中。
2.在平皿中剪碎肝脏组织并转移到匀浆器中。
3.在预冷的裂解缓冲液中添加PMSF/异丙醇储备液20？L/2mL。
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13)让胶完全凝结，室温下30-45min,小心拔出梳子，将凝胶安放到电泳槽中；
14)
15)向电泳槽中加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶1 mm；
16)
17)混合DNA样品和0.2倍体积的6xloading buffer,用微量移液器将样品混合液缓慢加至加样孔中；
18)
19)1关上电泳槽盖子，接好电极插头，设好电压和时间，按Run键，DNA应向阳极移动；
100 mM DHA
DHA原装瓶为50 mg，加入1758l DMSO溶解，配成浓度为100mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
100 mM 5-Fu
用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
实验方法
细胞冻存（HEK293细胞为例）
1.消化细胞并700rpm离心5min收集细胞；
DMEM细胞培养基
DMEM溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v)，青霉素100U/ml，链霉素100g/ml
McCoy’s5A细胞培养基
McCoy’s5A溶液90%(v/v)，FBS 10%(v/v),青霉素100 U/ml，链霉素100g/ml
实验试剂及药品的配制
1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)
2.
3.查询该基因有表达的细胞株，培养细胞，采用Trizol法提取总RNA。
4.
5.反转录。
6.
7.PCR：首先进行预实验，跑胶初步判断大小，摸索最佳退火温度和体系。然后进行回收目标片段。
8.
9.连接18T vector：载体和插入片段的比例为1:3。
10.
11.转化感受态细胞，筛选单克隆。
12.
13.挑取单克隆至1ml LB液体培养基（含抗生素）中，37℃，300rpm，约10~12 h，小抽并且进行酶切验证。
20)
21)当DNA样品或染料在凝胶中迁移了足够距离时，关上电源、拔下插头和打开电泳槽盖，取出胶放入凝胶成像仪中拍照。
22)
RT-PCR
1)根据所测的RNA的浓度，计算上样500 ng的RNA样品所需的体积，用DEPC水补至5 ul，加入1 ul的6xloading buffer进行电泳：120V、15 min。
G418 (Neomycin)
用PBS (pH 7.4)配成浓度为50 mg/ml的原液，0.22m滤膜过滤除菌，分装储于-20℃备用。
基因组DNA提取液
1 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)1 mL和0.1 mol/L EDTA (pH8.0)溶液20 ml，0.5% (m/v) SDS，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。
17）用适量ddH2O或者TE溶解DNA沉淀，得比较纯净的DNA，测浓度。
琼脂糖凝胶电泳
1)配制足量的电泳缓冲液（1xTAE或0.5xTBE）用以灌满电泳槽或配制凝胶；
2)
3)根据欲分离DNA片段的大小用电泳缓冲液配适宜浓度的琼脂糖溶液：准确称量琼脂糖干粉加到盛好电泳缓冲液的玻璃瓶中；
4)
5)玻璃瓶松松盖住，沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖溶化；
TAE电泳缓冲液(50×)
242 g Tris碱，57 ml冰乙酸，100 ml0.5MEDTA，加灭菌去离子水定容至1000 ml，使用时稀释50倍。
10% SDS
将10 g高纯度的SDS置于烧杯中，加入约80 ml的ddH2O，68℃加热溶解，滴加盐酸调节pH值至7.2，定容至100 ml后，室温保存。
500 mmol/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液(pH8.0)
在800 mL的双蒸水中加入18.6 g乙二铵四乙酸二钠，充分溶解后，用10 mol/L NaOH溶液调pH至8.0，用双蒸水定容到1000 ml。121℃高压灭菌15 min，备用。
溴化乙锭(EB)
1 g EB，加入100 ml灭菌双蒸水中，磁力搅拌数h以确保其完全溶解，然后转入棕色瓶中，4℃保存。
（solutionⅡ配置：0.4 M NaOH：2% SDS=1：1）；
5）加入3.5 ml预冷的solutionⅢ，轻柔颠倒几次，充分混匀，中和裂解液的碱性；
6）冰浴10 min，使杂质充分沉淀；
7）12,000 rpm离心10 min（4℃），轻轻吸取上清800 μl/管，转移至干净的1.5 ml离心管中；
蛋白提取液
1M Tris-HCl (pH7.6) 5 ml，5MNaCl 3 ml，10%SDS 1 ml，100% NP-40 1 ml，加灭菌去离子水定容至100 ml，备用。
100 mM姜黄素
用DMSO配成浓度为100 mM的储存液，分装避光储存于-20℃备用。
100 mM CPT-11
CPT-11原装瓶为50 mg，加入802l DMSO溶解，分装储存于-20℃备用。
6)
7)加入Buffer DE-B，混合均匀。
8)
9)将上步骤的所得液体加入DNA制备管中12,000×g离心1min，弃滤液。
10)
11)加入500ul Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。
12)
13)加700ul Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。
14)
2.
3.吸除上清，沉淀用冻存培养基（80% DMEM，10%FBS，10%DMSO，现配现用）充分重悬；
4.
5.将细胞悬液分装至冻存管中，1ml/管，标注细胞名称/型号、代数、日期、操作者，并迅速放于室温的冻存盒内；
6.
7.-80℃过夜，然后转移至液氮罐中冻存。
8.
细胞复苏（HEK293细胞为例）
1.将冻存的细胞迅速从液氮罐中取出，放入37℃水浴中进行溶解至无冰晶；
4℃forever
PCR产物胶回收
1)按照普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书步骤，制备含大加样孔的1%琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物加入加样孔。
2)
3)电泳结束后，在320nm波长紫外灯下根据Marker指示快速切取目的片段，用纸巾转移至Ep管，秤取其重量。
4)
5)加入相应体积的溶胶液Buffer DE-A，水浴锅75℃加热至凝胶完全融化（约6-8min）。
4)
5)氯仿200ul/管，剧烈震荡15s（Don’t Vortex！），使细胞充分裂解,室温静止3min.
6)
7)4℃，12000rcf，15min.
8)
9)转移500ul上清到相应的做好标记的1.5ml的离心管中，加入500ul/管异丙醇，颠倒混匀，室温静止10min。4℃，12000rcf，15min.
主要培养基的配制
LB液体培养基
胰蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1000 ml，用1 mol/L HCl调节pH至7.4，121℃高压灭菌20 min。如果需要加抗生素，则待灭过菌的培养基温度降到55℃以下后加入适量的抗生素储存液。
LB固体培养基
在LB液体培养基中加入2%琼脂。
6)
7)用隔离手套转移玻璃瓶到55℃箱内后，待溶化的凝胶稍冷却后加入EB，终浓度为0.5 ug/ml,轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液；
8)
9)琼脂糖冷却时，用一合适的梳子形成加样孔，梳齿的位置应在托盘底面上0.5-1.0 mm,这样琼脂糖浇灌到托盘时将形成符合要求的加样孔；
10)
11)浇灌温热的琼脂糖溶液进入模具；
10)
11)弃上清，加入用DEPC水配好的75%的乙醇1ml/管，颠倒两次后，放4℃离心机，7500rcf，5min.
12)
13)弃上清，等RNA干燥透明后加入30ul的DEPC水，吹打混匀使得RNA溶解后，1%凝胶电泳分析（100V 15-20 min），置于-80℃冰箱保存。
14)
基因克隆
1.查找目标基因的基本信息，查找相关文献，设计克隆基因方案。利用DNA处理软件和引物设计软件设计引物，将引物序列送公司合成，根据合成引物的退火温度确定PCR退火温度。
2.
3.取冻存的Ecoli,37 ℃融解后接种于LB平板上，37 ℃培养16-20h。
4.
5.在平板上挑取单菌落（2-3mm）,转到含有100mlLB培养基的1L的烧瓶中，37 ℃剧烈振荡培养（250-300r/min）3h。
6.
7.去1.5mlEp管，加入1mlLB培养基，再加入200ul菌液，37 ℃振荡孵育过夜（300rpm/min）。
14.
15.将沉淀用25ml预冷的0.1MCacl2重悬，按步骤7重复一次，弃去Cacl2溶液。
16.
17.用2ml 预冷的0.1MCacl2重悬沉淀（轻柔），然后在冰上放置1h.。
18.
19.在重悬的菌液中加入丙三醇（甘油）（15% v/v）(即857ul 50%灭菌甘油)，充分混匀后分装，200ul或100ul每管（1.5mlEp管），-80℃保存。
14.
15.测序：挑取酶切验证正确的阳性克隆送测序。
16.
17.根据测序结果，将测序正确的片段连接入真核表达载体。实验室有多种表达载体，根据需要选择。连接体系参考T4Ligase说明书。
18.
19.连接产物转化感受态，挑选阳性克隆进一步酶切验证，挑取阳性克隆中抽质粒并纯化，瞬转真核细胞（根据课题的方向选择细胞株），Western Blot验证所构建的表达载体是否在该细胞株中表达。
8.
9.在无菌的500ml烧瓶中加入50mlLB培养基，加入0.5-1ml 培养过夜的的菌液（即稀释50-100倍），然后与37 ℃300r/min 振荡孵育OD600=0.6(0.4-0.6)(约2h)。
10.
11.当菌液密度达到0.6以后，将菌液在冰上放30min.。
12.
13.将菌液在转入50ml离心管，4 ℃2500rpm, 离心20min,弃上清。