JC 线粒体膜电位的检测方法

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JC-1线粒体膜电位检测试剂盒

产品组成：

产品编号BB-4105-1 BB-4105-2 BB-4105-3

规格20 assays 50 assays 100 assays

JC-1 100ul 250ul 500ul

10×孵育缓冲液4ml 10ml 20ml

产品简介：

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式图上表现为FL1和FL2双阳性；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图中所有细胞FL1均为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

贝博线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)可以快速灵敏地检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位变化，可以用于早期的细胞凋亡检测。试剂盒染料与其他的阳离子染料如DiOC6(3)和罗丹明123相比，特异性更高，对线粒体膜电位变化的特异性高于质膜电位变化，对线粒体去极化检测的检测一致性更好；红绿色荧光强度比率只受线粒体膜电位的变化，不受线粒体大小，形状，密度的差异干扰；检测灵敏度强，对细胞应激反应的微小异质性都能辨别；

使用方法：

悬浮细胞

1、孵育缓冲液和JC-1染色工作液的配制：根据样品数按下列比例配制孵育缓冲液和JC-1染色工作液。取100ul 10×孵育缓冲液加900ul无菌纯水稀释，混匀并预热至37℃，即成1×孵育缓冲液；在500ul 1×孵育缓冲液中加入5ul JC-1，涡旋混匀配成JC-1染色工作液；

2、收集样本细胞以及阴性、阳性对照细胞。细胞数量在2-5X105个。

3、用PBS洗涤细胞两次。离心收集细胞。

4、用500ul JC-1染色工作液将细胞重悬，37℃，5% CO2的培养箱中孵育15分钟。

5、常温离心收集细胞。

6、用500ul预热的孵育缓冲液将细胞重悬。

7、用流式细胞仪或荧光分光光度计检测分析结果，或者用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察结果。

贴壁细胞

对于贴壁细胞，可以先收集细胞，重悬后参考悬浮细胞的检测方法。

纯化线粒体

1、把配制好的JC-1 染色工作液再用JC-1孵育缓冲液(1×)稀释5 倍。

2、0.9mL 5倍稀释的JC-1 染色工作液中加入0.1mL 总蛋白量为10～100ug的纯化的线粒体。

3、结果检测。

组织样本

组织样本可以用玻璃匀浆器匀浆成单细胞悬液后按照细胞样本的方法检测。也可以用其他细胞悬液制备的试剂盒处理组织后检测。

结果分析：

检测JC-1单体时可以把激发光设置为490nm，发射光设置为530nm；检测JC-1聚合物时，可以把激发光设置为525nm，发射光设置为590nm。

用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，绿色荧光通过FL1通道检测；红色荧光通过FL2通道检测。FL-1+,FL-2+为正常细胞，FL-1+,FL-2—为凋亡细胞。

用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察：检测JC-1单体时可以参考观察其它绿色荧光时的设置，如观察GFP或FITC时的设置；检测JC-1聚合物时可以参考观察其它红色荧光，如PI或Cy3时的设置。出现绿色荧光说明线粒体膜电位下降，并且该细胞很可能处于细胞凋亡早期。出现红色荧光说明线粒体膜电位比较正常，细胞的状态也比较正常。

用荧光分光光度计或荧光酶标仪检测：激发波长为485nm，发射波长为590nm。如果使用荧光酶标仪，激发波长不能设置为485nm 时，可以在475～520nm 范围内设置激发波长。

阳性对照的设置

一般不需要设置，如果要制备阳性对照细胞，可以用去极化药物羰基氰化物间氯苯腙CCCP作为诱导线粒体膜电位下降的阳性对照，按以下方法操作：CCCP加入到细胞培养液中，终浓度10uM，处理细胞20 分钟。随后进行线粒体膜电位的检测。对于大多数细胞，通常10μM CCCP处理20 分钟后线粒体的膜电位会完全丧失，JC-1 染色后观察应呈绿色荧光;而正常的细胞经JC-1 染色后应显示红色荧光。对于特定的细胞，CCCP 的作用浓度和作用时间可能有所不同，需自行参考相关文献资料决定。

参考文献：

● Gang Wang, JunJie Wang, Jie Luo et al.

PEG2000-DPSE-coated quercetin nanoparticles remarkably enhanced anticancer effects

through induced programed cell death on C6 glioma cells

Journal of Biomedical Materials Research 2013 （IF=2.625）