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第二章 病毒的培养
五、细胞培养 （一）细胞培养的条件要求 1、细胞密度 原代细胞：4~6×105个/ml 传代细胞：2~3×105个/ml 2、pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3、培养温度
（二）细胞培养的方法 1、单层细胞培养 2、悬浮细胞培养 3、微载体细胞培养
（三）原代细胞培养 基本步骤：
1、血清（serum） 1）血清的种类和来源
胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 新生牛血清(newborn calf serum, NCS) 成年牛血清(adult bovine serum) 马血清(horse serum) 鸡血清(chicken serum) 兔血清(rabbit serum) 羊血清(sheep or goat serum) 人血清(human serum)
７）细胞计数（培养时，使细胞达到5×105个/ml） 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总
数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K
（稀释倍数）。
○表示可计数 ●表示不计数
血细胞计数板
体外细胞的染色检测方法： 原理：死活细胞对染料的不同反应而区分开两 种细胞。 常用染料：中性红（活细胞着色，死细胞不着色）
2、长途运送细胞培养物的保存。 取刚长成单层的细胞培养物，弃去营养
液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留 空气，随后用橡皮塞紧塞瓶口，并作适当的 包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右， 到达目的地后，置37℃培养1天，再行传代。
（六）细胞培养物的冻存与复苏 1、培养物的冻存与复苏原理
冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在 加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般低于-70℃的超低温条件）， 并在此温度下对其长期保存的过程。 复苏(thawing)：以一定的温速率将冻存的培养物恢 复到常温的过程。
微生物学实验ppt课件
器材与试剂的选用原则
03
如无菌操作、适用性、经济性等
02
细菌形态与结构观察
细菌培养及形态特征
01
02
03
细菌培养方法
包括需氧培养、厌氧培养 和兼性厌氧培养等，不同 种类的细菌需要不同的培 养条件。
细菌菌落特征
观察细菌在固体培养基上 形成的菌落，了解其形状、 大小、颜色、透明度等特 征。
细菌细胞形态
05
微生物代谢活性测定
生长曲线测定方法
直接计数法
通过显微镜直接观察并计数微生物数量，适用于较大微生物如细 菌、酵母菌等。
比浊法
利用微生物生长引起培养液浊度变化来测定生长曲线，操作简便 但易受杂质干扰。
平板菌落计数法
将待测样品稀释后涂布于固体培养基表面，培养后计数形成的菌 落数，适用于可形成菌落的微生物。
原理
病毒必须寄生在活细胞内才能增 殖，通过提供适宜的细胞环境， 使病毒在细胞内复制并产生子代
病毒。
病毒检测技术及应用
免疫学方法
利用抗原抗体特异性结合的原理，通过酶联免疫吸附试验 （ELISA）、免疫荧光技术等检测病毒抗原或抗体。
分子生物学方法
基于病毒核酸的特异性，利用PCR、实时荧光定量PCR等技术扩增 并检测病毒核酸。
微生物学实验ppt课件
contents
目录
• 实验基础知识 • 细菌形态与结构观察 • 真菌形态与结构观察 • 病毒培养与检测技术 • 微生物代谢活性测定 • 微生物遗传与变异研究 • 微生物生态学及环境因子影响研究
01
实验基础知识
微生物学概述
类生活中的作用：如 生态平衡、发酵工业 等
生理生化鉴定
利用真菌的生理生化特性，如营养需 求、代谢产物等，进行进一步的分类 鉴定。
病毒培养方法
病毒培养方法病毒培养是研究病毒特性和生物学行为的重要手段，也是疫苗和抗病毒药物研发的基础。
正确的病毒培养方法能够保证病毒在细胞内稳定生长，为后续实验提供可靠的数据支持。
下面将介绍一般的病毒培养方法。
首先，选择合适的宿主细胞。
不同种类的病毒需要不同的宿主细胞进行培养，常用的宿主细胞有Vero细胞、HEK293细胞、MDCK 细胞等。
在选择宿主细胞时，需要考虑病毒对细胞的亲和性和感染能力，确保病毒能够有效地感染和复制。
其次，培养宿主细胞。
宿主细胞的培养条件对病毒的生长和复制起着至关重要的作用。
通常情况下，宿主细胞需要在无菌条件下培养，培养基的选择和配方也需要根据不同的宿主细胞进行调整。
在培养过程中，需要定期更换培养基，控制培养密度，以确保细胞的健康状态。
接着，感染宿主细胞。
将病毒悬液加入到培养基中，使病毒与宿主细胞发生感染。
感染后的细胞需要在适当的温度和湿度条件下进行培养，促进病毒的复制和扩散。
在感染后的一段时间内，可以观察细胞的形态变化和病毒效应，以判断感染情况。
最后，收获病毒。
当感染细胞出现明显的病毒效应并且病毒滴度达到一定水平时，可以收获病毒。
收获病毒时需要注意保持病毒的活性和纯度，通常采用离心、滤过等方法进行病毒精制。
收获的病毒可以用于后续的实验研究，也可以用于疫苗和药物的研发。
总之，病毒培养是病毒学研究中不可或缺的一环，正确的病毒培养方法能够保证病毒的活性和稳定性，为后续的实验提供可靠的数据支持。
在进行病毒培养时，需要严格控制培养条件，确保实验的可重复性和准确性。
希望本文介绍的病毒培养方法能够对研究人员有所帮助，促进病毒学研究的发展。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
实验六 病毒培养检测
3.接种部位：尿囊腔接种
4.接种量：0.1-0.2ml/胚
5.接种步骤：照蛋→标记→打孔→接毒→封孔→37 ℃孵化箱中继续孵化，及时照蛋，24h内死胚丢 弃，以后死亡者随时取出，冷藏，120h不死者， 冻死。
6.采毒：无菌采取尿囊液、羊水，即为病毒液。
1%鸡红细胞的制作：
1.抗凝剂的准备。常用的抗凝剂有肝素、柠檬酸三钠 等。
病毒培养检测
病毒检测对于病毒研究和病毒病的诊断 十分重要。检测病毒的方法有病毒的分离 和鉴定、病毒感染单位的测定、病毒颗粒 的检测、病毒的血清学检测、病毒为病毒的血凝，利用这种特性设计的实 验称为血球凝集实验（HA），以此来推测 被检材料中有无病毒存在，是非特异性的， 但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制， 即血球凝集抑制实验（HI），具有特异性。 通过HA-HI实验，可用已知血清来鉴定未知 病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中 的相应抗体和滴定抗体的含量。
5.吸弃上清液后将沉积的红细胞用生理盐水配成1% 红细胞悬液。
6.储存放于4摄氏度冰箱。
操作步骤：
结果判定
判定结果：以100%凝集的病毒的最大稀释孔 为该病毒的血凝价，即一个凝集单位，不凝 集者红细胞沉于孔底呈点状。
2.抗凝剂与血液的比例约为1:4。用一次性注射器抽 取适量抗凝剂后，采集鸡血。
3.将采集的混有抗凝剂的血液转移到离心管中，加入 约3倍体积的生理盐水，2000rpm，离心5min,吸弃 上清液。
4.生理盐水洗涤三次， 2000rpm，每次离心后吸弃 上清液，前两次离心5min，第三次离心10min。
一 目的要求
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种 途径； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖 过程，掌握接毒和收毒的方法； 3.掌握新城疫病毒效价检测方法—血 球凝集试验（HA）。
4.接种量：0.1-0.2ml/胚
5.接种步骤：照蛋→标记→打孔→接毒→封孔→37 ℃孵化箱中继续孵化，及时照蛋，24h内死胚丢 弃，以后死亡者随时取出，冷藏，120h不死者， 冻死。
6.采毒：无菌采取尿囊液、羊水，即为病毒液。
1%鸡红细胞的制作：
1.抗凝剂的准备。常用的抗凝剂有肝素、柠檬酸三钠 等。
病毒培养检测
病毒检测对于病毒研究和病毒病的诊断 十分重要。检测病毒的方法有病毒的分离 和鉴定、病毒感染单位的测定、病毒颗粒 的检测、病毒的血清学检测、病毒为病毒的血凝，利用这种特性设计的实 验称为血球凝集实验（HA），以此来推测 被检材料中有无病毒存在，是非特异性的， 但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制， 即血球凝集抑制实验（HI），具有特异性。 通过HA-HI实验，可用已知血清来鉴定未知 病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中 的相应抗体和滴定抗体的含量。
5.吸弃上清液后将沉积的红细胞用生理盐水配成1% 红细胞悬液。
6.储存放于4摄氏度冰箱。
操作步骤：
结果判定
判定结果：以100%凝集的病毒的最大稀释孔 为该病毒的血凝价，即一个凝集单位，不凝 集者红细胞沉于孔底呈点状。
2.抗凝剂与血液的比例约为1:4。用一次性注射器抽 取适量抗凝剂后，采集鸡血。
3.将采集的混有抗凝剂的血液转移到离心管中，加入 约3倍体积的生理盐水，2000rpm，离心5min,吸弃 上清液。
4.生理盐水洗涤三次， 2000rpm，每次离心后吸弃 上清液，前两次离心5min，第三次离心10min。
一 目的要求
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种 途径； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖 过程，掌握接毒和收毒的方法； 3.掌握新城疫病毒效价检测方法—血 球凝集试验（HA）。
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状病毒滴度测定) PPT
杆状病毒滴度测定
两种病毒滴度测定方法的比较：
空斑实验法测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染 周边细胞形成局灶型病变；而免疫染色法只需要病毒感染靶细 胞并表达病毒所编码的蛋白。因此，免疫染色法（infectious units per ml, or IFU/ml）测定病毒滴度需要的时间比空斑法 （PFU/ml）更短。
获得重组杆状病毒——转染Sf9 cells
1. 小提好的Bacmid DNA，置4 ℃不超过1周
2. 转染试剂：Cellfectin® ⅡReagent
3. 转染后细胞的形态变化
细胞 变大
增殖明显变慢 或不增殖
脱落 或
融合(VSV/G)
裂解
4. 收毒，短期内4 ℃避光保存，长期保存分装后置-80 ℃
杆状病毒表达系统(昆虫细胞的培养及杆状 病毒滴度测定)
杆
昆虫细胞的培养
状
病 重组pFastBac质粒的构建
毒
表
重组Bacmid的产生与鉴定
达
获得重组杆状病毒
系
统
蛋白表达&病毒扩大
Overview
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System能快速并有 效的获得重组杆状病毒，其重组是基于供体质粒表达盒 与杆状病毒穿梭载体Bacmid间发生位点特异性转座。
pipetting across the monolayer scraping cell scrapers hitting the flask against the palm of your hand
Preservation：
90% serum, 10% DMSO 严格程序降温，-80 ℃过夜后转移液氮保存。
【医学实验】禽流感病毒的鸡胚培养法 PPT课件
4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影 响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血， 不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现 沉淀就可以判定。
思考问题
加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？ 血凝试验设置空白对照的意义？ 病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍 数如十倍比稀释？
鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚 层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚培养的病毒接种
（一）活胚检查
1.血管 2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml 尿囊液。
2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第 3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。
3. 反复吹打3～4次第2孔，从混匀的第2孔中 丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀，再 吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9孔，第9 孔经稀释吹打后吸出0.4ml，
6）将烧杯中的细胞平均分配于5个25ml细胞瓶中， 补充1640培养基至3ml，置37 ℃培养
7）培养24小时后观察细胞的生长情况并描述细胞形 态。
原代细胞的培养与维持
1) 充分漂洗; 2) 起始的2天中尽量减少振荡; 3) 分离繁殖或测定病毒之用，细胞浓度可以加大，
尽量贴壁形成厚层； 4) 待细胞基本贴壁伸展并逐渐形成网状，此时的pH
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
微生物ppt课件
发酵工程制药
通过发酵工程技术生产各类生物药物，探讨其生 产工艺与质量控制。
环保治理技术
废水生物处理
01
利用微生物降解废水中的有机物、氮磷等污染物，实现废水达
标排放。
废气生物净化
02
运用微生物处理废气中的有害气体，降低大气污染物的排放。
生物修复技术
03
介绍微生物在土壤、地下水污染修复中的应用及原理。
消费者
某些微生物作为消费者，以其他生 物或有机物为食，参与能量流动和 物质循环。
对环境因素影响及适应机制
01
02
03
04
温度
不同微生物对温度有不同 的适应范围，如嗜热菌、 嗜冷菌等能在极端温度下 生存繁殖。
水分
微生物对水分的需求各异 ，如耐旱菌能在干旱环境 中生存，而水生微生物则 适应于湿润环境。
07
实验方法与技能培养
显微镜使用及观察方法
01
显微镜类型
了解光学显微镜、电子显微镜等类 型及其原理。
观察技巧
掌握调焦、调节光亮度、识别微生 物形态等基本观察技巧。
03
02
样品制备
学习如何制备不同类型的微生物样 品，如涂片、悬液等。
图像记录与分析
学习拍摄、保存和分析显微镜下的 微生物图像。
04
无菌操作技术及培养基制备
广泛分布于土壤、水体、空气以及生物体 内外，是自然界中数量最多的一类微生物 。
古菌
形态结构
与细菌相似，但具有一些独特的结构和代谢特征，如细胞壁不含 肽聚糖，细胞膜中含有独特的脂质成分等。
生活环境
主要生活在极端环境中，如高温、高压、高盐、缺氧等条件下，因 此又称为极端微生物。
营养方式和繁殖方式
通过发酵工程技术生产各类生物药物，探讨其生 产工艺与质量控制。
环保治理技术
废水生物处理
01
利用微生物降解废水中的有机物、氮磷等污染物，实现废水达
标排放。
废气生物净化
02
运用微生物处理废气中的有害气体，降低大气污染物的排放。
生物修复技术
03
介绍微生物在土壤、地下水污染修复中的应用及原理。
消费者
某些微生物作为消费者，以其他生 物或有机物为食，参与能量流动和 物质循环。
对环境因素影响及适应机制
01
02
03
04
温度
不同微生物对温度有不同 的适应范围，如嗜热菌、 嗜冷菌等能在极端温度下 生存繁殖。
水分
微生物对水分的需求各异 ，如耐旱菌能在干旱环境 中生存，而水生微生物则 适应于湿润环境。
07
实验方法与技能培养
显微镜使用及观察方法
01
显微镜类型
了解光学显微镜、电子显微镜等类 型及其原理。
观察技巧
掌握调焦、调节光亮度、识别微生 物形态等基本观察技巧。
03
02
样品制备
学习如何制备不同类型的微生物样 品，如涂片、悬液等。
图像记录与分析
学习拍摄、保存和分析显微镜下的 微生物图像。
04
无菌操作技术及培养基制备
广泛分布于土壤、水体、空气以及生物体 内外，是自然界中数量最多的一类微生物 。
古菌
形态结构
与细菌相似，但具有一些独特的结构和代谢特征，如细胞壁不含 肽聚糖，细胞膜中含有独特的脂质成分等。
生活环境
主要生活在极端环境中，如高温、高压、高盐、缺氧等条件下，因 此又称为极端微生物。
营养方式和繁殖方式
病毒的细胞培养PPT课件
细胞生长条件要求高
细胞需要在特定的温度、湿度、营养等条件下生长，且需要定期更 换培养基，操作复杂。
细胞变异问题
在长期培养过程中，细胞可能会发生基因突变和表型变化，影响实 验结果的稳定性和可靠性。
未来研究方向与展望
新技术应用
随着生物技术的不断发展，新型的细胞培养技术如微载体培养、三 维细胞培养等将为病毒的细胞培养提供新的解决方案。
成熟与释放
复制完成的病毒粒子从细 胞中释放出来，继续感染 其他细胞。
病毒的细胞培养方法
原代细胞培养
从动物组织中分离出的 细胞进行培养，可用于
某些病毒的培养。
传代细胞培养
将细胞系传代培养，可 用于多种病毒的培养。
组织块培养
将组织块切成小块进行 培养，可用于某些病毒
的培养。
悬浮细胞培养
将细胞悬浮在培养液中 进行培养，可用于某些
毒活性的药物。
药物评价
通过细胞培养技术，可以对抗病毒 药物的疗效进行科学评价，为临床 用药提供依据。
药物作用机制
研究抗病毒药物的作用机制，有助 于深入了解病毒的复制和致病机制， 为新药研发提供思路和方向。
04
病毒的细胞培养挑战与展望
病毒的抗药性问题
病毒抗药性的产生
病毒在复制过程中，可能会发生 基因突变，导致对药物的抗性增
病毒的致病机制研究
病毒复制
抗病毒免疫
通过观察病毒在细胞内的复制过程， 有助于了解病毒的复制机制和致病机 制。
研究病毒感染对机体免疫系统的影响， 有助于深入了解抗病毒免疫的机制和 过程。
细胞病变
研究病毒对细胞的损伤和病变，有助 于深入了解病毒的致病机制和病理变 化。
抗病毒药物的筛选与评价
药物筛选
细胞需要在特定的温度、湿度、营养等条件下生长，且需要定期更 换培养基，操作复杂。
细胞变异问题
在长期培养过程中，细胞可能会发生基因突变和表型变化，影响实 验结果的稳定性和可靠性。
未来研究方向与展望
新技术应用
随着生物技术的不断发展，新型的细胞培养技术如微载体培养、三 维细胞培养等将为病毒的细胞培养提供新的解决方案。
成熟与释放
复制完成的病毒粒子从细 胞中释放出来，继续感染 其他细胞。
病毒的细胞培养方法
原代细胞培养
从动物组织中分离出的 细胞进行培养，可用于
某些病毒的培养。
传代细胞培养
将细胞系传代培养，可 用于多种病毒的培养。
组织块培养
将组织块切成小块进行 培养，可用于某些病毒
的培养。
悬浮细胞培养
将细胞悬浮在培养液中 进行培养，可用于某些
毒活性的药物。
药物评价
通过细胞培养技术，可以对抗病毒 药物的疗效进行科学评价，为临床 用药提供依据。
药物作用机制
研究抗病毒药物的作用机制，有助 于深入了解病毒的复制和致病机制， 为新药研发提供思路和方向。
04
病毒的细胞培养挑战与展望
病毒的抗药性问题
病毒抗药性的产生
病毒在复制过程中，可能会发生 基因突变，导致对药物的抗性增
病毒的致病机制研究
病毒复制
抗病毒免疫
通过观察病毒在细胞内的复制过程， 有助于了解病毒的复制机制和致病机 制。
研究病毒感染对机体免疫系统的影响， 有助于深入了解抗病毒免疫的机制和 过程。
细胞病变
研究病毒对细胞的损伤和病变，有助 于深入了解病毒的致病机制和病理变 化。
抗病毒药物的筛选与评价
药物筛选
病毒培养技术
悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
有些病毒不产生CPE。 病毒收获：CPE达80％时收获，反复冻融多次使病毒释放，
然后离心除去细胞碎片，上清病毒液-20℃保存。 病毒毒价：TCID50、中和试验、AGP效价、HA
疫苗制造工艺流程
病毒性细胞疫苗制造工艺流程
病毒性组织疫苗制造工艺流程
细菌疫苗和类毒素制造工艺流程
寄生虫疫苗制备的工艺流程
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
RPMI-1640、199、 DMEM、F12
血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero （3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
流感病毒细胞分离培养ppt课件
• （5）倒掉消化液，瓶内留少许流体，再放37℃ 2’–3’， 取出手上轻轻拍打几下，这时可加已配好的生长液， 稍加吹打即可。一般情况下，1瓶细胞传3瓶 ，每2-3 天需传一代。
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3、MDCK细胞保存及复苏
MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加 而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞 作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90% 小牛血清。
• （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。
• （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。
• （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。
4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试
MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增
加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以
上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏
感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞
较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用
早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50
测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或
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2、单细胞的制备（略）
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3．细胞培养的基本条件：
• （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，
接种传代细胞一般为10—30万/ml。
• （ 2 ） 合 成 培 养 液 ： 如 Eagle 氏 液 ， RPMI1640 ，
Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也 适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水
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3、MDCK细胞保存及复苏
MDCK细胞对流感病毒的敏感性随其代数增加 而下降，故各实验室应液氮冻存代数较低的细胞 作为种子。一般保存液为含10%二甲基亚砜和90% 小牛血清。
• （ 2 ） 已 成 片 的 MDCK 细 胞 ， 将 其 生 长 液 倒 掉 。 用 Versene洗2遍。
• （3）把Versene与0.25%胰酶按7∶1比例配成消化液。
• （4）置37℃恒温箱5—10min，当细胞变圆，细胞与 细胞间互不相联，表明消化时间已到。如细胞仍连成 片，表明消化时间未到。
4、MDCK细胞对流感病毒敏感性测试
MDCK细胞对病毒的敏感性随其代数增
加而下降。故MDCK细胞在实验室传20代以
上时，一般需测试一下其对流感病毒的敏
感性。其具体测试法：选一株对MDCK细胞
较敏感的流感病毒株。在同一条件下，用
早代与要测试的MDCK细胞对其进行TCLD50
测定。如果测试的TCLD50比早代的低2个或
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2、单细胞的制备（略）
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3．细胞培养的基本条件：
• （1）细胞接种数：细胞量越大繁殖的速度越快，
接种传代细胞一般为10—30万/ml。
• （ 2 ） 合 成 培 养 液 ： 如 Eagle 氏 液 ， RPMI1640 ，
Eagle’s MEM。 不同培养液各有其特点，但往往也 适用于各种细胞培养，其主要成分为氨基酸、碳水
病毒的细胞培养
细胞培养的基本概念
传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接 种到新的培养器皿中。
原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长 的细胞在传代之前称为原代培养。
二 主要优点
㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。
5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液反 复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全从 细胞中释放出来
正常形态的鸡 胚成纤维细胞
接毒后发生病变的 鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞的特性，利 用该特性而进行的试验称为病毒的血凝试验。
细胞冻存方法
（1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min ，弃上清。
（2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至 106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传 代及冻存日期。
（3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然后 移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期保 存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度先 为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时，可 调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至-100℃时 ，再放入液氮罐中长期保存。
（4）细胞生长状况的观察
原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了解细胞形态
、数量及培养液pH值、污染与否等情况，以便采取相 应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
传代细胞应有充足的冻存储备。 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的绝种。
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细胞分类：根据细胞染色体和繁殖特性
• 原代细胞(primary cell)
• 细胞株(cell strain)
• 传代细胞（continued cell line） 细胞系(cell line)
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（1）原代细胞(primary cell)
指由新鲜组织经剪碎和胰酶消化制备的细胞，如CEF细胞。
⑤体重、年龄要基本一致，个体差别不宜过大。
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二、禽胚增殖病毒技术
（一）禽胚的选择
• SPF鸡胚
据国家标准，无22种特定病原体
• 非免疫鸡胚
应无特定病原的母源抗体，
• 普通鸡胚
可能带有鸡的多种病原体，不适用于疫苗生产
异源性性疫苗：鸭胚和鸽胚
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（二）禽胚接种途径与收获
• 绒毛尿囊膜接种法
能在体外无限传代，应用方便，其染色体数目及增殖特性
均类似于恶性肿瘤细胞，且多来源于癌细胞，如HeLa细胞系
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2．细胞培养方法
• 静置培养 • 转瓶培养 •悬浮培养(suspension cell culture ) •微载体培养(microcarrier cell culture) • 中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture) • 微囊化细胞培养
量最高，平均约6～8ml，羊水约1～2ml。 •接种部位：不应伤及胚体和血管，以免影响其发育 •严格防止禽胚污染
①鸡胚接种时严格无菌操作； ②定期清扫消毒孵化室，保持室内空气新鲜； ③种蛋入孵前先用温水清洗，消毒，凉干。
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三、细胞增殖病毒技术
1．细胞培养的概念
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化学方法使动物 组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液进行培养。
（2）细胞株(cell strain) 又称二倍体细胞
指自继代培养的细胞中选育出具有特殊生物学性质和标记的 细胞。这类细胞且能保持原来的二倍染色体数目，能连续传很 多 代 (50 ～ 100 代 ) ， 但 为 有 限 生 命 ； 没 有 肿 瘤 原 。 如 PKl5 、 BHK21和Vero
（3）传代细胞（continued cell line）\ 细胞系(cell line)
•中空纤维由乙酸纤维、聚氯乙烯－丙烯复合物或多聚碳酸硅 等材料制成，外径50~100µm，壁厚25~75µm，壁呈海绵状， 上面有很多微孔。
•中空纤维的内腔表面是一层半透性的超滤膜，允许营养物质 和代谢废物出入，而对细胞和大分子物质（如单克隆抗体）有 滞留作用。
•培养液能有效地分布，细胞培养维持时间可达数月，保持高
• 尿囊腔接种法 • 卵黄囊接种法 • 羊膜腔接种法 • 静脉接种法 • 脑内接种法
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鸡胚绒毛尿囊膜接种法
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尿囊腔接种法
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尿囊液收获方法
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鸡胚卵黄囊接种法
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（三）影响禽胚增殖病毒的因素
1．种蛋质量
①病原微生物：垂直传递，如白血病、脑脊髓炎、腺病毒、 支原体及传染性贫血因子等。
子）、结合蛋白（如转铁蛋白）、贴壁因子（如鱼精蛋白、
聚赖氨酸）和微量元素（如硒）四类几十种，多数无血清
培养液须补加3～8种血清替.新代. 因子。
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细胞接种量
细胞在生长过程中分泌刺激细胞分裂的物质，若细胞量太少， 这些物质分泌量少，而作用也小。
接种细胞数量越大，细胞生长为单层的速度越快，但细胞过多 对细胞生长也不利。
度活性，培养的细胞密度大，细胞分泌的蛋白质浓度高，纯度
可达60％～90％；占用空间小，适于各类细胞，但设备昂贵。
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பைடு நூலகம்
3. 细胞培养要素
•培养液 •血清 •细胞接种量 •pH •温度 •无菌条件 •培养器皿清洁度
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RPMI-1640、199、 DMEM、F12
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血清
• 成分：必需氨基酸、促进细胞生长和贴壁的成分。α-珠蛋 白和白蛋白能促进细胞生长；白蛋白具有毒作用；糖蛋白、 a2-球蛋白和β脂蛋白G2能促进细胞贴壁。
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悬浮培养
通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内 的培养方法，主要用于一些在振荡或搅拌下能生长繁殖的细 胞，如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞。
微载体培养
微载体直径应为60～105nm，无毒性，透明，颗粒密度与培 养液密度相近似，略重于液体，低速搅拌即能悬浮，不吸收 培养液和化学反应，表面光滑、硬度小、有弹性，易于细胞 吸 附 在 表 面 ， 如 DEAE—SephadexA-50 、 Cytodexl 、 Cytodex2、Cytodex3等。
②母源抗体：
③抗生素：立克次氏体和鹦鹉热衣原体
2．孵化技术
①温度：37～39.5℃。传染性支气管炎病毒37℃ ②湿度：鸡胚53％～57％，水禽胚比鸡胚高5％～10％。 ③通风：氧气，二氧化碳。
④翻蛋：
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3．接种技术
不同病毒的增殖有不同的接种途径， 同一种病毒接种不同日龄禽胚获得的病毒量也不同。 •接种日龄：鸡胚13～14日龄。鸭胚15～16日龄，尿囊液含
• 血清选择：同种动物优于异种动物血清；人和牛血清优于 马血清；马血清优于兔血清和鸡血清。
• 血清使用：目前国内多用犊牛血清，使用前须经56℃灭活 30min ， 并 进 行 细 胞 毒 性 试 验 。 生 长 液 血 清 含 量 一 般 为 5 ％～20％。维持液中血清量为0%～5％。
• 血清替代因子：激素和生长因子（如胰岛素、上皮生长因
微载体培养的容器为特制的生物反应器，有自动化装置。细
胞产量达106～107个/m1，每升培养液可加微载体2～5g，每
克有8000～9000个珠子，培养面积约为2～5万cm2，比常规
培养面积大10～25倍。
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中空纤维细胞培养(hollow fibre cell culture)
•组成:中空纤维生物反应器、培养基容器、供氧器和蠕动泵
病毒增殖技术
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动物增殖病毒技术 禽胚增殖病毒技术 细胞增殖病毒技术
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一、动物增殖病毒技术
选择动物的标准：
①大动物应来源于非疫区，最好是未接种过相应病毒疫苗、 青壮年和健康(经临床检查、检疫)；
②对相应病毒易感，并十分敏感；
③经隔离饲养和观察检查证明健康；
④家兔、小鼠、大鼠等应符合普通级或清洁级实验动物标 准；鸡应属非免疫鸡或SPF级标准；犬和猫应品种明确， 并符合普通级实验动物标准；