转录组学研究方法

EST相关数据库
储存EST原始数据的一级数据库
◆ EMBL ◆ GenBank (dbEST) ◆ DDBJ
对EST进行聚类拼接的二级数据库
◆ UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene) ◆ TIGR Gene Indices (http://www.tigr.org/tdb/tgi/)
全长 cDNA文 库构建
EST
90年代初Craig Venter 提出了EST的概念，并测 定了609条人脑组织的EST，宣布了cDNA大规模 测序的时代的开始 (Adams et al., 1991)。
EST（Expressed Sequence tags，表达序列标
签 ）是从已建好的cDNA库中随机抽取克隆，从5’ 末端或3’末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自 动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。
● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 ● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 ● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。【注：不过很难确 定一个新的序列是由于交替剪切产生的或是由于cDNA文 库中污染了基因组DNA序列(Wolfsberg et al., 1997)】
RT-PCR
RT-PCR是将RNA的 反转录（RT）和cDNA 的聚合酶链式扩增 （PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作 用从RNA合成 cDNA， 再以cDNA为模板，扩 增合成目的片段。
3’ RACE
以mRNA的
polyA为锚定
5’ RACE
原理上比3’RACE要
稍微复杂 要点: 逆转录酶 MMLV合成cDNA具 有加尾特性，即在合 成的cDNA链3’加上 3-4个dCTP，而且当 存在帽子结构时该酶 的加尾活性最高 然后以这段polyC为 锚定
Year
● 1993年前EST数据收录于GenBank， EBI和DDBJ。 ● 1993年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一个 专门的EST数据库dbEST来保存和收集所有的EST数据。 ● 95年中期GenBank 中EST的数目超过了非EST的数目。 ● 现在GenBank中EST的数目已经超过了三千五百万，约占GenBank中序 列数的60%.
上堂课内容
• mRNA检测技术 – 核酸杂交技术 – 原位杂交 – 逆转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR) – RACE – 全长cDNA文库 – Real-time PCR
核酸杂交
northern blot
探针制备
放射性同位素标记物 α-32P-dCTP 灵敏度达0.01pg
非放射性标记物 地高辛 灵敏度达0.1pg DIG-dUTP-----通过酶促反应掺入到DNA/RNA中去制成探 针----杂交----加抗地高辛-酶的复合物—加底物—显色
探测不同条件下的基因表达变化
28S rRNA 18S rRNA
B. WITEK-ZAWADA,2003
原位杂交1
FISH：Fluorescence
互补的碱基序列的单链DNA 即complementary DNA之缩 写。
酶在体外反转录成cDNA， 与适当的载体（常用噬菌体 或质粒载体）连接后转化受 体菌，则每个细菌含有一段 cDNA，并能繁殖扩增，这 样包含着细胞全部mRNA信 息的cDNA克隆集合称为该 组织细胞的cDNA文库。
以mRNA为模板，经反转录
In Situ Hybridization
原位杂交3
Moroz LL, 2006
逆转录(Reverse transcription)
逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚
合酶。这种酶是 1970 年美国科学 家特明 (H. M. Temin) 和巴尔的摩 (D. Baltimore) 分别于动物致癌 RNA 病毒中发现，他们并因此获 得 1975 年度诺贝尔生理学或医学 奖。
Growth of dbEST 40
Number of ESTs (millions)
35 30 25 20 15 10 5 0
19 93 19 94 19 95 19 96 19 97 19 98 19 99 20 00 20 01 20 02 20 03 20 04 2 1- 0 05 Ju n06
EST的应用 4：利用EST大规模分析基因表达水平
因为EST序列是从某特定组织的cDNA文库中随机测序而得到，所以可以用利 用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特定组织的基因表达谱。标准 化的cDNA文库和经过差减杂交的cDNA文库则不能反应基因表达的水平。 ◆ CGAP 为研究癌症的分子机理，美国国家癌症研究所NCI的癌症基因组解析计划 (Cancer Genome Anatomy Project , CGAP)构建了很多正常的或是癌症前期的 和癌症后期的组织的cDNA文库，并进行了大规模的EST测序，其中大部分的 文库未经标准化或差减杂交处理。 CGAP网站提供了多种工具用以分析不同文库间基因表达的差异, 如：
本堂课内容
Real-time PCR
转录组学基本研究方法 概念 基于测序的转录组学方法

EST 全长cwenku.baidu.comNA文库 生物信息学分析 基因芯片 生物信息学分析
基于杂交的转录组学方法

Real-time PCR 基本原理
Ct：threshold cycle
SYBR-Green荧光染料标定dsDNA
◆ STACK (http://www.sanbi.ac.za/Dbases.html)
EST的应用 1： EST与基因识别
EST已经被广泛的应用于基因识别，因为EST的数目比 GenBank中其它的核苷酸序列多，研究人员更容易在EST库中 搜寻到新的基因(Boguski et al., 1994).
能状态下所含mRNA的类型与拷贝数；比较不同功能 状态下mRNA表达的变化，搜寻与功能状态变化紧密 相关的重要基因群。
转录组学的研究方法
基于测序：全长cDNA文库、EST文库、SAGE 基于杂交：cDNA芯片（GeneChip，microarray） 基因表达聚类
cDNA文库
cDNA:为具有与某RNA链呈
理论上N1/N2
= 2^ΔCt 实际上PCR扩 增的效率并非 100%
N1 N2
ΔCt
什么是转录组、转录组学
• 转录组（Transcriptom）：细胞所包含mRNA的总和。
与基因组不同的是，转录组的定义中包含了时间和空 间的限定。
• 转录组学（Transcriptomics）：研究细胞在某一功