基因工程作业

1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。

2、切口平移是指在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，使5’磷酸基团带上放射性标记。

在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。

3、下列哪一种酶作用时需要引物（B）反转录酶在作用时需要DNA聚合酶，而后者需要引物A、末端转移酶B、反转录酶C、DNA 连接酶D、限制酶4、下列DNA片段，最可能含有SstI 酶切位点的是（A）ＡGGAGAGCCTCT ＢGAGCACA TCT ＣCCCTGTGGGAＤA TCCTACATG ＥAACCTTGGAADNA连接酶的作用特点有哪些？1、DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）2、需要能量、Mg2+3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。

1、5’—3’聚合酶活性：以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链2、3’—5’外切酶活性：主要起校对作用3、5’—3’外切酶活性：从5’端降解DNA分子何谓Star activity？简述Star activity 的影响因素及克服方法？限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。

当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性，称为星号（*）活性。

（1）高甘油含量（>5％, v／v）；（2）限制性内切核酸酶用量过高（>100U／ugDNA）；（3）低离子浓度（<25 mmol／L）；（4）高pH（8.0以上）；（5）含有机溶剂，如DMSO（二甲基亚砜），乙醇等；（6）有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+，Cu2+，Co2+，Zn2+等）。

举例说明在基因工程中修饰性工具酶具有的重要用途1、末端转移酶：同聚物加尾克隆DNA片段，再生酶切位点便于回收克隆片段，标记DNA 片段的3’末端2、多核苷酸激酶：催化5’羟基末端磷酸化便于DNA分子连接标记DNA或RNA的5’段3、碱性磷酸酶：去除DNA或RNA分子的5’末端磷酸基团，防止线性化的载体分子自我连接；与多核苷酸激酶共同作用，标记DNA5’末端用 T4 phage DNA polymerase 可进行末端标记，试简述其原理？用3’—5’外切酶活性作用于所有末端形式的3’端制造出3’隐蔽端，再利用它的5’—3’聚合酶活性补平，并加入放射性标记的32P-dNTP。

标记的dNTP逐渐取代被删除掉的原有的核苷酸，因此叫做取代合成。

1、下列哪种克隆载体对外源DNA 的装载量最大（B）A、粘粒B、酵母人工染色体（Y AC)C、质粒D、λ噬菌体2、pUC18 与pUC19 的区别在于（B）A、二者的选择标记不同B、二者MCS方向相反C、pUC18 无lacZ 基因D、pUC19 无lacZ 基因3、M13 单链噬菌体的复制分为三个阶段，以下哪一项不属于此（C）A、SS→RFB、RF→RFC、RF→SSD、SS→SS4、下列有关质粒分子生物学的叙述，错误的是（B）Ａ、质粒是共价环状的双链DNA 分子Ｂ、天然质粒一般不含有限制性内切酶的识别序列Ｃ、质粒在宿主细胞内能独立于染色体DNA 自主复制Ｄ、松弛复制型的质粒可用氯霉素扩增Ｅ、质粒并非其宿主细胞生长所必需5、带有多个不同种复制起始区的质粒是（A）Ａ、穿梭质粒Ｂ、表达质粒Ｃ、探针质粒Ｄ、整合质粒Ｅ、多拷贝质粒6、考斯质粒（cosmid）是一种（B）Ａ、天然质粒载体Ｂ、由DNA 的cos 区与一质粒重组而成的载体Ｃ、能裂解受体细胞的烈性载体Ｄ、具有溶源性质的载体Ｅ、能在受体细胞内复制并包装的载体7、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是（A）Ａ、Cosmid > DNA > PlasmidＢ、DNA > Cosmid > PlasmidＣ、Plasmid > DNA > CosmidＤ、Cosmid > Plasmid > DNAＥ、DNA > Plasmid > Cosmid8、下列载体常用选择性标记中属于营养缺陷型的是（E ）Ａ、tsr Ｂ、Apr Ｃ、lacZ Ｄ、Tcr Ｅ、Trp-9、载体质粒pBR325 共有三个选择性标记：Apr、Tcr、Cmr 。

它们分别含有一个单一酶切位点：PstI、SphI和EcoRI。

若将一外源基因取代此载体上不含Cmr标记基因的PstI-SphI 限制性DNA片段，那么用于转化子和重组子筛选的试剂应是（D）Ａ、Ap Ｂ、Tc Ｃ、Cm Ｄ、Ap + Tc Ｅ、Ap + Cm10、构建GST蛋白表达系统的载体是为了是目标蛋白以（A）方式表达？A、融合表达B、分泌表达C、独立表达D、包含体表达1、λ噬菌体根据接受外源DNA的方式不同，可以分为插入型和置换型两种类型载体。

2、黏粒载体是由质粒和噬菌体DNA共同构成的。

3、就一个基因（DNA片段）来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：复制起始位点（ORI）、多克隆位点（MCS）、选择性标记基因。

另外，一个理想的质粒载体必需具有低分子量。

4、原核表达载体的表达元件主要包括启动子、核糖体结合位点和终止子。

5、基因工程构建基因重组体是指将目的基因与载体进行连接重组载体：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞复制、整合或表达的工具质粒的不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存的现象柯斯载体：柯斯质粒是人工建造的的含有λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体基因打靶：通过DNA同源重组，使细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，或在基因组特定的位点插入外源基因RNAi：当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（dsRNA）时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，什么是克隆载体，克隆载体必需满足哪些基本条件？能够通过限制性内切酶将目的基因片段整合进去，并且能够转入宿主细胞内进行表达的生物生物DNA1、对受体可转移性，2、宿主细胞内能独立复制3、有一段多克隆位点，供外源DNA插入4、具有合适的选择标记性，用于含有重组质粒的宿主细胞的筛选表达载体需要的基本元件及其作用？ORI：结合用于复制起始的酶选择性标记：用于筛选重组克隆体MCS：用来插入外源基因表达调控元件（启动子，核糖体结合位点RBS，终止子）：使外源基因表达蛋白产物简述RNAi的作用机制外源dsRNA 进入细胞后产生的小分子干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC具有结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程1、Southern bloting 杂交能够检测外源基因是否整合进受体细胞基因组；外源基因的转录表达需要通过Northern bloting来揭示；而外源基因蛋白质水平的表达则需通过免疫学检测或Western杂交才能揭示，其使用的探针是特异性抗体。

2、碱变性抽提法提取质粒DNA的原理是利用染色体与质粒DNA的变性与复性存在着差异达到分离的目的。

3、分离DNA时使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。

4、确定分离的基因是否具有与天然基因相同序列的唯一方法，也是最准确的方法是基因测序。

5、下列哪种PCR技术不能根据已知部分序列获得未知序列（D）A、RACEB、TAIL-PCRC、反向PCRD、巢式PCR6、免疫印迹法筛选重组体的原理是（D）A、根据载体抗性基因的表达B、根据载体报告基因的表达C、根据DNA与mRNA的杂交D、根据外源基因的表达1、反向PCR ：扩增已知DNA片段两侧的未知序列2、实时定量PCR：在PCR体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析的方法。

3、斑点印迹杂交：在Southern印迹杂交的基础上发展而来,通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交，以检测核酸样品中是否存在特定的DNA或RNA4、RT-PCR：利用反转录酶，把mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。

5、菌落或噬菌斑杂交：将标记的核酸探针直接与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交2、什么是简并引物？设计简并引物时如何降低简并度？简并引物：一个氨基酸可对应一个到多个密码子，因此一段氨基酸序列可以有多个可能的编码序列，合成这一段序列作PCR扩增体系的引物既为简并引物。

（1）在选取氨基酸序列时往往优先选择对应密码子较少的残基；（2）选取氨基酸序列的长度一般为5个，对应一段15个碱基的核苷酸序列；（3）放弃最后一个氨基酸对应密码子的第三位碱基，合成14个碱基的简并引物。

3、在PCR反应的后期，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有那些？PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程成为平台效应。

①dNTP、引物浓度降低，掺入速度变慢②随产物增加，酶与模板比例下降③非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争④产物的再结合1、经典RACE克隆的原理是什么？有何意义？原理：3’RACE：由含有oligo（dT）的接头引物引发合成cDNA第一链，根据中间核心序列设计出上游引物，与3’引物扩增第一链cDNA，可得到全长cDNA的3’末端序列。

5’RACE：先用oligo（dT）引发合成cDNA第一链，然后在第一链cDNA的3’端加上人工锚定序列，利用5’锚定引物及3’特异性引物进行扩增，得到全长cDNA的5‘末端序列。

意义:根据已得到的不完整cDNA序列设计引物对3’和5’端进行克隆从而获得全的cDNA 克隆2、什么是Genomic library？与cDNA library有何区别？基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。

理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。