细胞迁移侵袭实验操作步骤

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细胞迁移侵袭试验技术(Transwell)

细胞迁移侵袭试验技术(Transwell)

细胞迁移侵袭试验技术(Transwell)迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster 和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭试验技术(Transwell)

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迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤

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细胞迁移侵袭实验操作步骤(T r a n s w e l l)(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面,使用请直接删除迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA 的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)

迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验(cell migration assay)实验介绍ﻫ细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究得细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中得成分可以影响到上室内得细胞,应用不同孔径与经过不同处理得聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面得研究。

1材料准备:ﻫ可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶得(Coster与实验步骤:ﻫCorning公司得也较常用),Transwell迁移实验得细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买得Transwell小室相配套,BD公司得Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM与1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌P BS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0、1%(g/ml)PBS结晶紫)ﻫ2步骤与流程ﻫ2。

1基质胶铺板:用BD公司得Matrigel1:8(根据细胞产生mmp得量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜得上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶、使用前进行基底膜水化。

ﻫ2、2制备细胞悬液ﻫ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12—24h,进一步去除血清得影响。

但这一步并不就是必须得、②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA得无血清培养基重悬、调整细胞密度至5×105/ml。

ﻫ2。

3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室、ﻫ②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS 得培养基,特别注意得就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液得趋化作用就减弱甚至消失了,在种板得时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤

Transwell实验原理与操作步骤Transwell实验,也被称为细胞侵袭实验,是一种研究细胞迁移和侵袭能力的实验方法。

其基本原理是将小室放入培养板中,小室内称为上室,培养板内称为下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。

上室内添加上层培养液,下室内添加下层培养液,并将研究的细胞种在上室内。

由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞生长、运动等。

在进行不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜的实验时,可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

在肿瘤细胞侵袭实验中,需在聚碳酸酯膜上侧铺一层基质胶,用以模仿细胞外基质。

肿瘤细胞必须分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质消化了才能进入下室(这与体内情况较为相似)。

最后通过计算进入下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。

有侵袭能力的细胞才可用于Transwell侵袭实验。

建议实验前先用明胶酶谱法检测MMPs的表达,特别是MMP-2的表达。

Transwell实验的具体操作步骤如下:1.实验前的准备工作:需要提前一天将Matrigel胶(一种人工合成的细胞外基质)从冰箱中取出,放置在冰盒上融化。

同时,将24孔板、枪头、离心管等实验器材也放置在冰盒中预冷。

2.基质胶铺板:将融化好的Matrigel胶与无血清培养基按照1:8的比例混合,然后用预冷的枪头将混合液均匀铺设在Transwell小室的上室底部,注意要避免产生气泡。

铺好后将小室放入37℃的培养箱中孵育30分钟,使Matrigel胶凝固。

3.细胞处理:将需要研究的细胞进行传代或复苏,并用无血清培养基洗涤两次,然后用胰酶消化并计数。

4.接种细胞:将计数好的细胞用无血清培养基重悬,然后取适量细胞悬液加入到Transwell小室的上室中,注意要保证每个小室的细胞数量一致。

5.添加培养液:在上室和下室中分别添加适量的含血清培养基,上室的培养基中可以含有研究药物或其他处理因素。

6.培养细胞:将Transwell小室放入37℃的培养箱中培养24-48小时,具体时间可以根据研究目的和细胞类型进行调整。

细胞迁移侵袭实验操作步骤

细胞迁移侵袭实验操作步骤

细胞迁移侵袭实验操作步骤(T r a n s w e l l)(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面,使用请直接删除迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA 的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(汇编)

迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(新)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)(新)

迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)迁移实验(cellmigrationaay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Tranwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Tranwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coter和Corning公司的也较常用),Tranwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Tranwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Tranwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5某105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100μl加入Tranwell小室。

②24孔板下室一般加入600μl含20S的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。

侵袭及迁移实验流程及实验设计_修改补充

侵袭及迁移实验流程及实验设计_修改补充

Transwell侵袭实验(根据细胞不同,细胞加入小室的数量不同)1.实验前准备:分装好的Matrigel从-20度取出,4度冰箱过夜融化。

2.包被基底膜:准备50mg/L Matrigel 1:8稀释液(用无血清培养液稀释Matrigel,比例为:Matrigel胶比无血清培养液为1:8),按每个小室需50ul来算,进行配制,配制时注意在冰上操作,因胶容易受热凝固。

将配制好的稀释液以每个小室50ul加入。

放置于37度孵箱3小时。

3.水化基底膜:吸出培养板中的残余液体,每孔加入50ul含10g/L BSA(牛血清白蛋白)的无血清培养液,37℃,30min.4.将处理(干扰或过表达)了24小时后的细胞消化,离心,无血清培养液清洗一次,再用无血清培养液重悬,调整细胞密度至2X105/ml,取100ul加入小室,注意细胞在无血清培养液中容易贴壁,所以数完细胞后要再吹打离心管后在往小室内加细胞。

每组3个重复。

5.24孔板中小室下面加入500ul有血清培养基。

注意提起小室看看是否下部有气泡产生。

6.常规培养细胞48小时后取出。

PBS轻轻淋洗,去除残留的培养基7.取出后用棉签小心擦去小室上层胶,4%多聚甲醛固定20分钟,置于2.5%结晶紫溶液中染色30分钟。

取出后PBS洗至无颜色改变。

8.镜下观察结果。

注意:1.Matrigel的相关处理要遵循无菌原则,但不要将其置于紫外灯下照射杀菌,紫外线会破坏胶中生长因子,影响实验结果2.包被基底膜要在冰上操作,否则还没包被完就在室温中凝固了,会造成胶的浓度不均一3.加样及取放培养板动作一定要轻柔,防止下层培养基产生气泡!4.培养过程中细胞由于呼吸作用可能会在培养液中出现小气泡(一般都在边缘),这是正常现象,可不处理。

但若培养一段时间小室下出现大气泡则问题严重。

因此种细胞后2h一定要拿出培养板观察是否出现大气泡,若有则需及时处理。

5.注意观察下层培养液中脱落细胞数量,如果比较多就可能是造成穿膜细胞少假象的一个主要原因6.固定及染色时都要在24孔板中进行,不要将小室取出倒扣然后滴加固定液或染色液7.染色前要将膜风干,否则可能会染不上。

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验

细胞迁移和侵袭实验细胞迁移和侵袭实验实验准备:细胞,24孔板,transwell小室(8μm,24孔板专用),ECM Gel,10%FBS+培养基,无血清培养基,10 μ、200 μL、1000 μL移液器及配套枪头,1.5 mL EP 管,冰盒实验设计:实验分组一般分为阴性组(上下层均没有趋化因素),实验组(按照实验需要,上层或者下层加入趋化因素),对照组(趋化因素与实验组中的相反)。

如果有特别需要,可以再加上阳性组(上下层都有趋化因素)。

实验操作(请细读注意事项):一、细胞侵袭实验1.ECM Gel原液提前1 h放在4 ℃冰箱中解冻,实验前转移到冰盒中。

2.将1.5 mL EP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后,置于冰上预冷。

3.根据自己的使用量,按照ECM Gel : 无血清培养基=1 : 7.5在冰上稀释成使用液。

4.把枪头剪去一小段(约3 μm)后在冰上吸取40 μL/孔ECM Gel 使用液轻轻加入transwell上室中,加入时慢慢移动枪头,保证液体平铺在底部。

5.放在37 ℃孵箱15 min,让胶凝固。

6.消化、离心、计数细胞后,按照2.5x104 / mL用无血清培养基稀释细胞,制成细胞悬液(如果细胞很多,这一步可以提前,在4、5之前做)。

7.按照每孔200 μL,将细胞悬液加入transwell上室,同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500 μL,放入37 ℃孵箱培养。

8.若干小时后取出,吸去transwell上室多余液体,用PBS清洗两次,用棉棒在上室中轻轻转动,吸干水分并擦去膜内侧的细胞。

9.在上室中加入结晶紫染液,染色5 min,回收染液,用流水缓缓冲去染液,再次用棉棒在上室中轻轻转动,吸干水分。

10.在正置显微镜上放置一块载玻片,将transwell小孔倒置放在上面,拍照。

11.在100倍视野下,对膜的上下左右及中间计数,做平均数。

12.清洗transwell,可以反复使用。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)之欧阳家百创编

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)之欧阳家百创编

迁移实验(cell migration assay)欧阳家百(2021.03.07)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程 2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)及细胞生活的环境教学设计

细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)及细胞生活的环境教学设计

细胞迁移与侵袭实验将 Transwell 小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成份可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

可拍照显微镜, Transwell 小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster 和 Corning 公司的也较常用),Transwell 迁移实验的细胞培养板 24 孔板。

细胞培养板应当与购买的 Transwell 小室相配套,BD 公司的 Matrigel,无血清 DMEM, (1%胎牛血清)DMEM 和 1640 培养基, DMEM 彻底培养基, 1640 彻底培养基(也可加到 20%血清),无菌 PBS ,棉签,胰酶, 4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1% (g/ml) PBS 结晶紫)用 BD 公司的 Matrigel 1: 8 (根据细胞产生 mmp 的量来决定)稀释,包被 Transwell 小室底部膜的上室面,置37 ℃30min 使 Matrigel 聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿 12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液, (用 PBS 洗 1- 2 遍),用含 BSA 的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

①取细胞悬液100µl 加入 Transwell 小室。

②24 孔板下室普通加入600µl 含 20%FBS 的培养基,特殊注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特殊留心,一旦浮现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③培养细胞:常规培养 12-48h (主要依癌细胞侵袭能力而定) 。

细胞迁移侵袭实验操作步骤

细胞迁移侵袭实验操作步骤

细胞迁移侵袭实验操作步骤(T r a n s w e l l)(总4页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面,使用请直接删除迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA 的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

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实验介绍
细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。

实验步骤:
1材料准备:
可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。

细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(%(g/ml)PBS结晶紫)
2步骤和流程
基质胶铺板:
用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。

使用前进行基底膜水化。

制备细胞悬液
①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。

但这一步并不是必须的。

②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。

调整细胞密度至5×105/ml。

接种细胞
①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。

②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。

24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。

结果统计
直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的
下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。

取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。

%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。

400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。

实验材料
(1)Transwell chamber: 24-well, μm pore membranes (Corning)
(2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,%EDTA (3)固定液:甲醇
(4)染色液:Giemsa染液
(5)封片剂:中性树胶
(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片
操作步骤
(1)所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育;
(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105 /ml;
(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培养基,上室加入100-150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时;
(4)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟;
(5)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中,室温染色15-30分钟;
(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;
(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;
(8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。

注意事项
(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。

常用的为μm孔径(如AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径;
(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。

常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well,迁移时间12≈36小时;
(3)由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Corning);(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),具体可查阅相关文献;
(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平;
(6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。

但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞,以免影响读数。

尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破;
(7)Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组;(8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。

细胞侵袭实验(cell invasion assay)
实验材料
(1)Matrigel (BD 5mg/ml),-20℃保存
(2)其余材料同迁移实验
操作步骤
(1)Matrigel在4℃过夜融化;
(2)用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作;
(3)在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel,37℃温育4-5小时使其干成胶状;
(4)后续步骤同迁移实验(1-8)。

注意事项
(1)Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷;
(2)铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡;
(3)其他注意事项同迁移试验。

其他
Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤
(1) 基质胶准备:将冻存于-80度冰箱的BD matrigel 4度过夜(24h),变成液态;(2)取300ul无血清培养基,加入60ul(或50ug/每室)Matrigel ,混匀,( 4℃操作,最好在冰浴上),加入上室各100ul(3个室);放入37℃培养箱中,孵育4-5h(>5h);此间经常观察,当出现“白色层”时,说明已经变为固态。

注释:无血清培养基和基质胶按1:5稀释,每孔加50ul,在37℃培养箱中1-2h。

(3)消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液;
(4)用无血清培养基洗 Matrigel洗1次;每孔加入100ul细胞悬液;
(5)下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基;
(6)37℃培养箱中,孵育20-24h;
(7)取出transwell用PBS洗2遍, 5%戊二醛固定,4℃;
(8)加入结晶紫(%)染色或Giemsa染色(5-10min),室温,PBS洗2遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察。

迁移实验
transwell在24孔板中浸泡1小时;消化细胞,无血清培养基洗 2 次,计数,配成细
胞悬液,每孔加入100ul细胞悬液;加药刺激;下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子;37℃培养箱中,孵育 20-24h;取出 transwell用 PBS洗2遍,5% 戊二醛固定, 4℃;PBS洗2遍,加入结晶紫(%)染色,室温,PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察计数 10 照相,记录。

侵袭实验
取 300ul 无血清培养基,加入 30ul (或 50ug/ 每室) Matrigel ,混匀,( 4 ℃操作,最好在冰浴上),加入上室各 100ul ( 3 个室);放入 37 ℃培养箱中,孵育 4-5h ( >5h );消化细胞,无血清培养基洗 3 次,计数,配成细胞悬液;用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次;每孔加入 100ul 细胞悬液;下腔室中加入 600ul 无血清条件培养基;37 ℃培养箱中,孵育 20-24h;取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定, 4 ℃;PBS 洗 2 遍,加入结晶紫( % )染色,室温, PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察
transwell小室是否可以重复利用,该怎样消毒
用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2,效果很好。

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