微生物菌种分离和鉴定技术
实验五 微生物的分离、接种及培养法
实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。
2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。
二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。
在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。
因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。
微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。
三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。
2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。
3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。
四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。
具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。
（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。
（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。
然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。
分离培养的操作方法
分离培养的操作方法分离培养是一种常用的微生物学实验技术，它可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
本文将介绍分离培养的操作方法。
一、准备工作1.准备培养基：根据需要分离的菌种选择适当的培养基，如营养琼脂、血琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂等。
2.准备培养器具：培养皿、移液器、灭菌器、无菌吸管、无菌匀板器等。
3.准备消毒液：如70%乙醇、84消毒液等。
4.准备样品：从需要分离的样品中取一定量的菌落或液体悬浮液。
二、分离操作1.表面分离法：将样品涂布在培养基表面，用无菌匀板器均匀涂布，然后在培养皿中培养。
此法适用于分离菌落较大的菌种。
2.液体分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，使菌落分散在培养基中，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
3.稀释分离法：将样品加入到含有适当营养物质的液体培养基中，进行逐级稀释，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
4.过滤分离法：将样品过滤，将过滤液接种到含有适当营养物质的液体培养基中，摇晃培养，然后取适量的液体培养基接种到新的培养基中，重复操作数次，直到分离出单一菌种。
三、培养条件1.温度：根据菌种的生长特性选择适当的温度，如常温、37℃等。
2.气氛：根据菌种的生长特性选择适当的气氛，如需氧气、需二氧化碳等。
3.时间：根据菌种的生长速度选择适当的培养时间，如24小时、48小时等。
四、鉴定分离菌株1.形态学鉴定：观察菌落形态、大小、颜色等特征。
2.生理生化鉴定：通过菌株的代谢特性、生长条件等进行鉴定。
3.分子生物学鉴定：通过PCR、DNA测序等技术进行鉴定。
分离培养是一种重要的微生物学实验技术，可以将混合菌群中的不同菌种分离出来，单独培养，以便于对不同菌种进行研究和鉴定。
在进行分离培养时，需要注意无菌操作，选择适当的培养基和培养条件，以及对分离出的菌株进行鉴定。
微生物分离鉴定步骤
微生物分离鉴定步骤
微生物的分离和鉴定是微生物学研究中非常重要的步骤，它可
以帮助我们了解微生物的种类和特性。
通常，微生物的分离和鉴定
包括以下步骤：
1. 样品收集，首先需要收集来自环境、生物体表面或其他来源
的微生物样品。
这可能涉及到采集土壤、水样、食品、空气或生物
体组织等样品。
2. 稀释和接种，将样品进行适当的稀释，然后在培养基上进行
接种。
这有助于分离出单一的微生物菌落，以便进行后续的鉴定。
3. 培养，接种后，将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。
不同
类型的微生物可能需要不同类型的培养条件，如温度、氧气含量等。
4. 分离，在培养一段时间后，可以观察到菌落的形成。
选择单
一的菌落，进行分离培养，以获得纯培养物。
5. 形态学特征观察，观察微生物的形态学特征，包括细胞形态、大小、颜色等，可以初步了解微生物的特征。
6. 生理生化特性测试，进行一系列生理生化特性测试，如对不同营养物质的利用、酶活性、氧气需求等，以进一步了解微生物的特性。
7. 分子生物学鉴定，利用分子生物学方法，如16S rRNA序列分析，可以对微生物进行更精确的鉴定，包括确定其属种和种的分类位置。
以上是常规的微生物分离和鉴定步骤，通过这些步骤可以全面地了解微生物的特征和分类位置。
值得注意的是，不同的微生物可能需要不同的鉴定方法，有时可能需要结合多种手段进行鉴定，以确保鉴定结果的准确性。
细菌的分离、培养和鉴定
② 加富培养基：在基础培养基中加入某些特殊营养物质 （如血液/血清、酵母浸膏或生长因子等）；用以培养对 营养要求高的微生物（2216E）
③ 选择培养基：利用细菌对某种或某些化学物质的敏感性 不同；在培养基中加入这类物质，利于所需分离的细菌生 长，而抑制不需要的细菌生长，从而达到分离某种微生物 的目的。（中国科学院海洋研究所专利：一种定量检测鳗弧 菌的选择性培养基及其制备）【利用鳗弧菌对氨苄青霉素的抗性 】
④ 鉴别培养基：是一类含有某种特定化合物或试剂的培养
基。某种细菌在这种培养基上培养后，产生某种代谢产物，
能与这种特定化合物或试剂发生某种明显的特征性反应；
从而达到区分不同的微生物.。（TCBS）
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ ❖ 病料在接种培养基后，经过一段时间，应检查其 生长状况。首先用肉眼检查有无细菌生长；若有， 则需进一步检查菌落是否纯一。形态特征包括： 大小、形状、突起或扁平、凹陷、边缘（光滑、 波形、锯齿状、卷发状等）、颜色（红色、灰白 色、黄色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度 （不透明、半透明、透明等）和粘度等
水可直接涂布平板
• 平板置于28℃ 恒温培养箱培养24h，观察细菌生
长状况
（注意：操作台在使用前后都需要用酒精棉球擦拭
台面，保持操作台的整洁）
.
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二、细菌的培养
培养基：培养基是指由人工方法配合而成的，用于微生物 培养、分离、鉴别、研究和保存菌种用的混合营养制品。
培养基的种类
① 基础培养基：含有一般细菌生长繁殖需要的基本营养物 质；可作为一些特殊培养基的基础成分（普通营养琼脂）
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生化鉴定管
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养 基质的分解能力也不一样，因而代谢产物 或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用
微生物菌种分离和鉴定技术
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征
遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标
本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长，
是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
菌种的分离与纯化
接种、分离纯化和培养技术一、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。
１、接种工具和方法在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。
由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。
有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。
在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。
（图３－３）图３－３接种和分离工具1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种这是最常用的接种方法。
即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。
常用的接种工具有接种环，接种针等。
在斜面接种和平板划线中就常用此法。
２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。
此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。
除三点外，也有一点或多点进行接种的。
３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。
做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。
用的培养基一般是半固体培养基。
它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。
４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。
待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。
５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。
６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至固体培养基中，都可称为液体接种。
７）注射接种该法是用注射的方法将待接的微生物转接至活的生物体内，如人或其它动物中，常见的疫苗预防接种，就是用注射接种，接入人体，来预防某些疾病。
分离和鉴定微生物的方法
分离和鉴定微生物的方法微生物是一种充满生命力的生物体，它们无处不在，在自然界中发挥着不可替代的作用。
但是，随着人类活动的不断扩大，人们逐渐认识到微生物对人类生命健康的潜在威胁。
因此，需要分离和鉴定微生物，以了解其特征和功能，从而保护人们的健康与安全。
一、分离微生物的方法分离微生物是微生物学研究的基础，它通常包括以下步骤：1. 采样：根据研究目的和样本来源的不同，可以选择不同的采样方法，如直接采集、培养物、土壤、水和空气等。
2. 稀释涂布：根据采样量的大小和样本来源的不同，可以将样本进行适当的稀释处理，然后涂布在培养基上。
3. 培养：将涂布的样本置于适当的培养条件下，如温度、湿度、氧气含量和营养成分等，培养期间观察和记录微生物的生长情况。
4. 纯化：从培养物中选取单一的菌种，通过传代和筛选的方法，使其获得纯种状态。
5. 保存：对保留的纯菌种进行存储和传承。
二、鉴定微生物的方法鉴定微生物是指对已分离出的微生物进行鉴定和分类，以确定其种属、亚种或生物型。
通常包括以下步骤：1. 形态学特征：通过对微生物形态的观察和描述，如大小、形状、色素、菌落形态等，初步鉴定其种属。
2. 生理生化特征：利用微生物生长与代谢的特性，如对不同碳源、氮源和微量元素的利用，产生的酶类和代谢产物，以及对常见药物的敏感性和抗性等，进一步鉴定其亚种或生物型。
3. 分子生物学特征：利用分子生物学技术，如DNA序列分析、PCR扩增和序列比对等，对微生物进行基因型鉴定，解决传统鉴定技术无法区分的问题。
三、常见的微生物分离和鉴定方法1. 培养方法：是微生物分离和鉴定的最基本和重要方法，主要应用于细菌和真菌的鉴定。
包括富营养培养基和选择性培养基，常用的有Mcleod、MacConkey、Sabouraud等。
2. 快速检测方法：是以快速、高效、准确为主要特点的微生物检测方法。
包括免疫学方法、核酸检测方法、质谱分析方法等。
3. 超微结构分析方法：是通过电子显微镜观察微生物的超微结构，如形态、细胞壁、胞膜、内质网、菌核等，进一步鉴定和分类微生物。
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术原理及其应用-文档资料
微生物的分离与培养技术是微生物学实验室中最基本、最重要的实验技术之一。
其主要原理是将混合微生物群落分离为单一的微生物菌落，并在适宜的环境条件下使其生长繁殖形成单一菌种培养物，以便进行鉴定和研究。
1.微生物的分离技术
（1）稀释涂布法：将微生物混合液逐渐稀释，然后取一定量的稀释液涂布在富养基平板上，待菌落形成后，挑取单一菌落进行培养和研究。
（2）过滤法：利用微孔膜或滤纸将混合液过滤，将过滤后留在微孔膜或滤纸上的微生物进行培养和研究。
（1）液体培养：将微生物接种在富足的液体富养基中，置于适当的温度、光照和通气条件下进行培养。
（3）混合培养：将两种或以上的微生物同时接种在同一富养基上进行培养，这一技术可同时培养多种微生物，缩短实验时间。
3.技术应用
微生物的分离与培养技术在微生物学研究、医学诊断、生物工程和食品工业等领域都得到广泛应用。
（1）微生物学研究：分离单一菌种进行研究，为微生物学研究提供基础。
（2）医学诊断：从临床样品中分离出致病微生物进行培养与鉴定，有助于快速准确地诊断、鉴定和治疗病原微生物感染。
（3）生物工程：在微生物培养基中添加营养物质，用微生物进行合成、代谢和分泌等反应。
（4）食品工业：将微生物培养在富有营养的富养基中进行发酵，生产出发酵食品。
微生物代谢产物的分离提取和鉴定
微生物代谢产物的分离提取和鉴定微生物代谢产物是微生物在生长过程中产生的一系列化合物，具有广泛的生物活性和医药应用价值。
其分离提取和鉴定是微生物学研究中的重要内容之一。
1. 微生物代谢产物的分离提取微生物代谢产物的分离提取可以通过以下几种方法进行：1.1 生物筛选法生物筛选法是利用微生物自身代谢特性进行分离提取的方法。
通过对微生物菌种的筛选和培养，可以筛选出产生特定活性物质的微生物。
随着技术的不断发展，生物筛选法已经成为了有机合成方法的重要补充。
1.2 萃取法萃取法是通过溶剂的物理性质差异对微生物代谢产物进行提取的方法。
通常使用有机溶剂（如氯仿、乙酸乙酯、丙酮等）进行萃取，将样品与溶剂混合，使化合物转移到到溶液中，然后再经过干燥等处理得到分离提取物。
1.3 分离柱层析法分离柱层析法是将萃取物通过固相柱进行分离的方法。
柱层析常用于研究样品中单一化合物的分离和纯化。
主要利用化合物在某些材料表面的化学吸附和排斥作用分离化合物，从而得到纯度较高的代谢产物。
2. 微生物代谢产物的鉴定微生物代谢产物的鉴定可以通过以下几种方法进行：2.1 紫外-可见吸收光谱法紫外-可见吸收光谱法是利用化合物分子在特定波长的光照射下所产生的吸收作用实现鉴定的方法。
这种方法非常适用于含有含电子共轭体系的化合物，如吲哚、噻吩类化合物等。
2.2 质谱法质谱法通常被视为微生物代谢产物鉴定的“金标准”。
它可以提供高灵敏度、高分辨率、高质量的分析结果，从而鉴定出代谢产物的分子式、结构特征和精确的分子量等信息。
2.3 核磁共振波谱法核磁共振波谱法是一种非常常用的分析方法，其主要原理是通过核磁共振现象对化合物进行鉴定。
不同类型的原子具有不同的核磁共振反应，从而可以进一步鉴定分子中含有哪些原子，并得到化合物的结构信息。
3. 结语微生物代谢产物的分离提取和鉴定是微生物研究中的重要环节，它为揭示微生物代谢途径、开发新型抗生素等提供了重要的实验支持。
随着科技的不断发展，微生物代谢产物的分离提取和鉴定技术也将不断地完善和提高。
菌种分离鉴定报告
菌种分离鉴定报告引言菌种分离鉴定是微生物学的一项重要研究方法，通过对搜集到的样品进行菌种分离和鉴定，可以更好地了解和研究微生物的特性和功能。
本报告旨在对所分离到的菌种进行鉴定，并详细描述鉴定过程和结果。
材料和方法1.样品搜集：本次分离鉴定的样品为土壤样品，样品采集于XX地区的农田土壤中。
采集过程中注意避免污染。
2.菌种分离：将样品制成稀释液后，通过涂布法将其均匀涂布在琼脂平板上，然后在适宜的温度下培养24小时。
3.菌落筛选：从培养好的琼脂平板上挑取形态、颜色和大小不同的菌落，用无菌的铁环或鉗子分别转移到新的琼脂平板上。
4.纯化培养：将转移到新平板上的菌落进行连续传代培养，使其形成纯种菌株。
5.生理生化特性鉴定：通过一系列常规的生理生化试验，如形态特征观察、革兰氏染色、氧需求性测试、酸碱反应性测试等，对菌株的基本特性进行鉴定。
6.分子生物学鉴定：根据16S rRNA基因测序，利用序列比对和系统发育树构建等方法，进行分子生物学鉴定。
结果经过以上步骤，我们成功分离和鉴定了多个菌株，并获得了以下结果：1.菌株A：–形态特征：菌株A为圆形菌落，边缘整齐，直径约为3mm。
–革兰氏染色：菌株A为革兰氏阳性菌。
–氧需求性：菌株A为嗜氧菌。
–酸碱反应性：菌株A在甲酸钠培养基上呈酸性反应。
–分子生物学鉴定：分子生物学鉴定结果显示，菌株A的16S rRNA序列与已知菌种XXX高度相似。
2.菌株B：–形态特征：菌株B为不规则形状的菌落，边缘模糊，直径约为5mm。
–革兰氏染色：菌株B为革兰氏阴性菌。
–氧需求性：菌株B为嫌氧菌。
–酸碱反应性：菌株B在乙酸钠培养基上呈中性反应。
–分子生物学鉴定：分子生物学鉴定结果显示，菌株B的16S rRNA序列与已知菌种YYY非常相似。
3.菌株C：–形态特征：菌株C为有规律的菌落，直径约为2mm。
–革兰氏染色：菌株C为革兰氏阳性菌。
–氧需求性：菌株C为厌氧菌。
–酸碱反应性：菌株C在葡萄糖盐酸钠培养基上呈弱碱性反应。
微生物的分离与纯化实验报告
微生物的分离与纯化实验报告实验目的：
通过实验了解微生物分离的基本原理和方法；掌握微生物纯化方法，了解常用的分离培养基和微生物培养条件。
实验原理：
微生物的分离和纯化是微生物学中的基本实验技术之一。
微生物分离的基本原理是把混合菌落使之分离成单一菌落，并将分离出的单一菌落进行种类鉴定。
微生物纯化是指从混合菌落中将目标微生物菌种分离出来并纯化到原核培养物中。
实验步骤：
1. 原始样品的处理
将样品取一定量于无菌 Erlenmeyer瓶内，加入相应容积的生理盐水，均匀搅拌，并制成1：10、1：100、1：1000等稀释液。
2. 稀释液接种分离培养基
将稀释液通过平板涂布法、斜面培养法或混悬液播种法接种于相应的分离培养基中。
3. 观察菌落生长情况
分别观察不同菌液在不同培养基中生长情况，并根据菌落特征确定是否为单一菌种。
4. 分离纯化单一菌落
通过稀释、涂片和感染小白鼠等方法，将菌落分离纯化并制备鉴定鉴定纯菌株。
实验结果：
通过实验，我们成功地从样品中分离出多种微生物，并用分离纯化方法分离出了单一的微生物菌种。
结论：
通过微生物的分离和纯化实验，我们掌握了微生物分离的基本原理和方法，成功分离出单一菌种并加以鉴定。
这对于微生物学基础研究和其它相关领域具有重要的意义。
菌种分离纯化的方法
菌种分离纯化的方法以菌种分离纯化的方法为标题，本文将介绍菌种分离纯化的方法及其步骤。
菌种分离纯化是微生物学研究中常用的一种技术手段，通过分离和纯化菌株，可以获得单一的菌种用于后续的研究和应用。
一、菌种分离的基本原理菌种分离的基本原理是将混合的微生物菌群分离成单一的菌株。
菌种分离的方法有很多种，常用的有单菌落分离法、稀释涂布法、稀释液滴法等。
这些方法都是基于微生物菌株的生长特性和培养条件的不同，通过合理设计实验步骤和培养基，使目标菌株能够单独生长并形成可见的菌落。
二、菌种分离纯化的步骤1. 样品采集：首先需要从环境中采集到含有目标菌株的样品。
样品可以是土壤、水样、食品、动植物组织等，根据研究目的和样品特点选择合适的采集方法。
2. 制备培养基：根据目标菌株的特性和需求，选择合适的培养基配方，并进行消毒和制备。
培养基的选择应考虑到菌株的营养需求、生长条件和特殊要求。
3. 稀释涂布法：取少量样品加入到培养基中，经过适当的稀释后，用移液管或铁环在培养基表面均匀涂布，使菌落能够单独生长。
4. 单菌落分离法：根据菌落的形态、颜色和大小等特征，选择单一的菌落转移到新的培养基上。
可以使用鉴别培养基或显微镜观察菌落的特征，以确保分离的菌株纯度。
5. 重复分离：为了确保分离得到的菌株的纯度，可以进行多次的分离操作。
将单一菌落进行二次分离或多次传代培养，直到得到纯种的菌株。
6. 菌种保存：分离纯化后的菌种可以进行保存，常用的保存方法有冷冻保存和冷冻干燥保存。
冷冻保存需要将菌种在液氮中冷冻保存，冷冻干燥保存则是将菌种在低温下干燥保存。
三、菌种分离纯化的注意事项1. 采集样品时要注意卫生和无菌操作，避免外源菌的污染。
2. 制备培养基时要严格按照配方和操作规程进行，确保培养基的质量和无菌性。
3. 分离过程要注意避免交叉污染，使用无菌操作和无菌工具。
4. 分离后的菌株要进行鉴定和鉴别，确保其为目标菌株。
5. 分离纯化后的菌株要进行保存，以备后续使用。
微生物菌种选育
株，苏云金杆菌模式菌株等细菌、食用菌等大型真菌、林 木病原菌、菌根菌、病虫生防菌、木腐菌、病毒和植原体 类等。 中国工业微生物菌种保藏管理中心:保藏各种工业微生物菌种 资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌 。 中国医学细菌保藏管理中心: 兽医微生物菌种保藏管理中心:
美国典型菌种保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC）
三、菌种分离思路
1：新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要 求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所 需要的菌种挑选出来。
2:实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行 分离纯化。
3：有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的 设备与之配合。
8、几种微生物纯培养分离方法的比较
1）固体稀释平皿法： 即可定性,又可定量,用途广泛;
2）平皿划线分离法： 方法简便,多用于分离细菌;
3)组织分离法: 高等真菌及植物病原菌。
4）单细胞挑取法： 局限于专业化的科学研究；
5）利用选择培养基法： 适用于分离某些生理类型较特殊的微生物。
二、菌种的来源
1、根据资料直接向有科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买；
细菌的分离与鉴定
土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：
KH2PO4 1.4g NaH2PO4 2.1g MgSO4`7H2O 0.2g 葡萄糖 10.0g 尿素 1.0g 琼脂 15.0g ①从物理性质看此培养基属于哪类？从功能上属 于哪类培养基？ 固体培养基 选择培养基 ②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？
(5)计数时,如果使用16格×25格规格的计数室,要按 对角线位,取左上,右上,左下,右下4个中格(即100个 小格)的酵母菌数.如果规格为25格×16格的计数板, 除了取其4个对角方位外,还需再数中央的一个中格 (即80个小方格)的酵母菌数. (6)当遇到位于大格线上的酵母菌,一般只计数大方 格的上方和右方线上的酵母细胞(或只计数下方和左 方线上的酵母细胞). (7)对每个样品计数三次,取其平均值,按下列公式计 算每1ml菌液中所含的酵母菌个数.
• 抑制非目的微生物生长
• 从混杂微生物中分离目的微生物
1、利用选择培养基进行直接分离
选择培养基 只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其 他微生物生长的培养基
选择培养基
可抑制细菌、放线 菌细胞壁主要成分 肽聚糖的合成
其细胞壁是由纤 维素、几丁质、 葡聚糖组成
加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入四环素、卡那霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞
③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。 ④涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以 三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌 落数在50个左右为最好。
分离菌种的方法范文
分离菌种的方法范文分离菌种是微生物学中的一个重要实验技术，通过该技术可以将混合菌群中的不同菌种分开，单独培养和研究。
本文将介绍几种常用的分离菌种的方法。
1. 稀释平板法（Dilution plate method）稀释平板法是最常用的分离菌种的方法之一、首先将混合菌液用无菌生理盐水或培养基稀释到一定浓度，然后将其均匀涂布在含有固体培养基的平板上，培养一段时间，单个菌落可以形成单菌种的菌落。
然后将单菌种的菌落分离种植到新的培养基上。
2. 悬液均匀法（Spread plate method）悬液均匀法也是一种常用的分离菌种的方法。
首先将混合菌液用无菌生理盐水或培养基进行稀释，然后将其均匀涂布在含有固体培养基的平板上，通过新颖的方案将单个菌种的菌落分离种植到新的培养基上。
3. 筛网过滤法（Mesh filtration method）筛网过滤法适用于一些难以通过稀释平板法和悬液均匀法分离的微生物，如真菌和放线菌等。
该方法使用特制的网状滤膜过滤混合菌液，将微生物困集在滤膜上形成菌落，然后将菌落分离种植到新的培养基上。
4. 琼脂半固体培养法（Semi-solid agar medium method）琼脂半固体培养法适用于一些具有较长延伸子菌丝或芽孢状细胞的微生物，如放线菌等。
该方法在培养基中加入适量的琼脂，并均匀混合，然后将混合菌液转移到琼脂半固体培养基上，等菌落生长后，可通过菌落根部的单菌种分离种植到新的培养基上。
5. 微滴法（Micropipette method）微滴法是一种高效的分离菌种的方法。
该方法使用微量移液器将混合菌液分别吸取并滴入含有固体培养基的小孔板中，每个孔中仅有一个细胞。
随后，孔中细胞生长形成单菌种的菌落，然后将菌落分离种植到新的培养基上。
分离菌种方法的选择取决于待分离菌种的特点和实验目的。
这些方法可以大大提高单个菌种的纯度和分离效率，有助于后续的菌种鉴定和研究。
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理
微生物纯种分离,培养及接种技术实验原理微生物纯种分离、培养及接种技术是微生物学中最基本的实验技术之一。
其目的是从混合的微生物菌群中分离出单一的微生物菌落，并在适宜的培养条件下进行纯化和生长，以获得纯种微生物。
一、实验器材和试剂1.灭菌针2.毛细胞计数板3.显微镜4.平板接种器、针头5.无菌匀浆棒、吸管6.细菌培养基7.消毒液二、实验步骤1. 样品处理及制备首先需要选择一份待测试的样品，包括土样、水样、空气、食品等，然后将样品采集到无菌容器中，再将其送到实验室。
在进行样品处理之前，需要先进行简单的初步处理，将样品进行稀释或者过滤，将其中的杂质和大颗粒物去除，以利于后续实验的操作。
接下来需要进行制备培养基，根据不同的微生物种类，需要选择适当的培养基进行培养。
通常情况下，我们可以使用凝胶培养基、液体培养基、甜菜汁培养基等，以满足微生物在不同环境下生长所需的营养物和成分。
2.分离纯化分离纯化是该实验的关键步骤。
将经过预处理的样品移到无菌试管中，打开试管口，加入适量的制备好的培养基，然后利用匀浆棒或吸管将混合物均匀混合。
然后利用平板接种器将混合物接种到培养基平板上，使其密切接触。
然后将接种好的平板置于恒温箱中，以利于微生物的生长和营养物质的自我繁殖。
在接种后2-7天内，不同类型的微生物将在培养基平板上生长出不同的菌落，每一种菌落都代表一种单一的微生物。
将这些菌落分离提取，并再次进行培养，就能得到单纯的微生物菌种。
3.纯种微生物菌种接种在获得单纯的微生物菌种之后，需要将其再次接种到培养基中进行培育。
将相应体积的纯种菌种接种到培养基平板上，使其能够生长繁殖。
在接种后约24小时内，微生物将在培养基中生长出许多菌落。
根据菌落的特征和形态，可以对不同的微生物进行鉴定和分类。
如果需要进行更加深入的分析，可以对微生物菌种进行进一步培养、萃取定量和测序等工作，以获取更多的相关信息。
三、实验注意事项1. 实验前需要保证实验室内部环境和仪器均为无菌状态。
微生物学中的菌种鉴定
微生物学中的菌种鉴定微生物学是研究微生物的学科，其中的菌种鉴定是非常重要的实验。
菌种鉴定指的是对微生物分离物进行鉴定，判定其种属、属名、种名、亚种名等，以推断其生物学性质、生理生化特性、环境适应性及其与环境和人体的关系。
该鉴定方法主要包括形态学、生理生化特性、分子生物学等几种方法。
本文将针对这几种方法分别进行探讨。
一、形态学鉴定形态鉴定是通过对微生物的形态特征进行观察来判断其种属等分类学性质。
比如，通过观察菌落的颜色、形态、大小以及结构等，来辨别不同的微生物种类。
在形态鉴定过程中，需要使用到各种显微镜和染色技术。
形态鉴定的优点在于简便易行，只需要显微镜和染色试剂即可进行鉴定，同时还不需要非常高的技术水平。
不过，该方法也存在一些缺点，如繁琐、时间长、误判率高等。
二、生理生化特性鉴定生理生化特性鉴定是通过检测微生物的代谢活动、分泌产物和利用不同的碳、氮源等物质来鉴定其分类学性质。
在鉴定时，需要进行生理生化试验，包括氧耗量测定、碳水化合物酸代谢测定、氮代谢测定等。
相对于形态鉴定而言，生理生化特性鉴定可以更加全面地了解微生物的特点，同时误判率也较低。
但是，需要进行大量的试验，加之试验条件较为苛刻，因此操作难度较大。
三、分子生物学鉴定分子生物学鉴定是利用分子生物学技术对微生物基因信息进行测定，包括基因测序、DNA指纹图谱等。
该方法可以在非常短的时间内进行微生物鉴定，同时鉴定结果也非常准确。
除此之外，该方法还可以进行菌株的溯源和进化分析等。
然而，该鉴定方法在技术要求上比前两种高，需要进行基因测序等高级技术操作，因此其操作难度较大。
结语虽然以上的几种鉴定方法各有优缺点，但在实际应用中，三者的优缺点是可以互补的。
根据不同的鉴定需求和条件，可以进行不同的选择和结合应用。
总之，微生物学中的菌种鉴定对于科学研究和应用都起到了非常重要的作用，不断优化完善菌种鉴定方法也是未来微生物学研究的重要方向之一。
微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏实验
实验微生物菌种的分离纯化、培养、鉴定及保藏一、实验目的和要求1.了解微生物的分离纯化方法。
2.学习检测水中大肠菌群的方法。
3.学习微生物的保藏及鉴定方法。
4.熟悉革兰氏染二、实验原理多管发酵法多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。
乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。
1.初发酵试验水样接种于发酵管内，37℃下培养，24小时内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。
48小时后仍不产气的为阴性结果。
2.平板分离初发酵管24至48小时内产酸产气的均需在复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂，平板上划线分离菌落。
3.复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。
原理与初发酵试验相同，经24小时培养产酸产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。
三、实验器材及试剂1.水样污水样本2、培养基及试剂：二甲苯、苯酚、琼脂粉、香柏油、乳糖胆盐液体培养基、伊红美蓝琼脂（EMB）、营养琼脂培养基、革兰氏一液、革兰氏二液、革兰氏三液、革兰氏四液。
3、器材及耗材:双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、纱布、吸耳球、产气管、培养皿、移液管等四、实验方法及步骤1.第一天实验前的准备1）配制3支乳糖胆盐液体培养基，每支10mL，并加入产气管。
配置营养琼脂培养基，灌装进2支试管中，配置200mL伊红美兰培养基150mL,于121℃高温高压灭菌20分钟，后放进恒温干燥箱。
2）包扎5套培养皿，包扎6根1mL、1根10mL移液管和3支滴管。
于121℃高压灭菌锅中灭菌20分钟。
3）称取一定量的液体石蜡，约为锥形瓶的三分之一。
于121℃高温高压灭菌20分钟。
微生物的分离、纯化、培养与初步生化鉴定
微生物的分离、纯化、培养与初步生化鉴定09级生命科学与技术基地班摘要此次实验主要是对微生物进行分离，纯化，培养与初步生化鉴定。
通过实验了解培养基的配制及干湿灭菌的原理、方法。
用简单单细胞挑取法和平板分离法分离纯化微生物，对其进行形态特征的观察并掌握平板菌落计数法的原理和方法。
了解不同微生物对各种有机大分子的水解能力，不同微生物有不同的酶系统，掌握大分子实验在微生物鉴别中的作用，掌握糖发酵、IMVIC的原理、方法和在肠道细菌鉴定中的作用。
关键词培养基灭菌分离与纯化鉴定IMVIC前言培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
不同微生物选用不同培养基，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。
分离纯化方法很多，基本原理相似，即将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落，常用方法有简单单细胞挑取法，平板分离法。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。
获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
微生物的培养特征是指微生物在固体培养基、半固体和液体培养基中生长后所表现的群体形态特征。
不同的微生物具有不同的培养特征，固体培养基又分为平板和斜面两种。
不同来源的样品接种于平板培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内会形成菌落。
每一种细菌所形成的菌落有它自己的特点，如菌落的大小，表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明或半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。
可通过平板培养来检测不同的材料中微生物的数量和类型。
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基因型鉴定技术水平
不同指纹图谱和DNA分析技术的鉴定水平
多相鉴定实例
ATCC16404黑曲霉 Aspergillus niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
表 ITS序列特殊位点碱基差异 Table Difference of base position in ITS sequence
图：ATCC 16888和ATCC 16404的培养特征和显微形态 a´nos Varga, Sa´ndor Kocsube´ , Bea´ ta To´ th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 1925–1932
单细胞（或单孢子）分离法是采取显微分离法
从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进 行培养以获得纯培养。 较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体。 个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪， 在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取 单个微生物细胞或孢子以获得纯培养 。 单细胞分离法对操作技术有比较高的要求。
2、玻璃三角涂棒浸入酒精 3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼烧后使其冷却 4、无菌涂棒将样品均匀涂布琼脂培养基表面，适当条件下培养
平板划线法
斜线法
曲线法
方格法 放射法
四格法
平板划线法
斜线法：
用接种环以无菌操作挑取菌悬液一环，先在 平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条， 再转动培养皿70°角，并将接种环上剩余物 烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二 次平行划线，再用同法通过第二次平行划线 部分作第三次平行划线和通过第三次平行划 线部分作第四次平行划线。
多相分类 （Polyphasic taxonomy）
根据相似性或亲缘关系 确定分类类群（分类单元）
鉴定 （Identificaiton）
确定新的分离物属于 已知分类单元的过程。
微生物菌种鉴定技术
未知菌种鉴定:它是什么菌？
微生物菌种鉴定
常规鉴定
目标菌检验：它是不是某一种菌?
控制菌：
大肠埃希菌（ Escherichia coli） 致病菌：
微生物菌种检验
大肠埃希菌（ Escherichia coli） 大肠菌群（Coliform） 大肠菌群（Coliform） 沙门菌（Salmonella） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 沙门菌（Salmonella） 单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogene 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa） 阪岐肠杆菌（Enterobacter sakazaki） 致贺氏菌（ Shigella ） 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus） 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni） 梭菌（Clostridium） 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens） 蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ） 白假丝酵母（Candida albicans）
摇匀、冷凝 在琼脂柱表面倾倒一层灭菌 液体石蜡和固体石蜡的混合物
培养后，菌落形成在琼脂柱的中间
液体培养基分离
不能在固体培养基上生长的微生物仍需要用液
体培养基分离来获得纯培养。
稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。
在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数
（一般应超过95%）表现为不生长。
单细胞（孢子）分离
图1: 基于ITS DNA序列的黑色曲霉N-J树 Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences. 注：图片来源于Reclassification of ATCC® 16404TM and ATCC® 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2008, Vol. 14 (10): 2-14
ATCC16404 黑曲霉 Aspergillus
niger
2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新种发表 2008年 ATCC 16404 鉴定为 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2010年 WDCM 将ATCC 16404 更名 2010年 USP 将ATCC 16404 更名
微生物菌种鉴定技术
表征（表型）特征 形态特征 生理和代谢特征 生态特征 遗传（基因型）特征 蛋白质比较 核酸碱基组成 核酸序列
分子标尺
多相鉴定技术 Polyphasic Identification Technology
Erko Stackebrandt, DSMZ, Braunschweig, Germany
规范的检测鉴定方法 GB/T 4789.3-4.5.6.7.9.10.13.14.30.40
常规鉴定
首先掌握菌株的基本特征，如细胞的形状、革兰 氏染色及其他形态学特征；营养类型、需氧性等 生理生化特征。 在此基础上查阅分类（鉴定）手册，确定菌株属 于哪一大类（群、组），进行特征测定。 根据测定结果逐步缩小菌株的归属范围，初步确 定科、属。 如菌株需鉴定至种，则进一步测定种的鉴别特征。 如鉴定结果涉及新的分类单元，则进行包括基因 型在内的全面鉴定。
单细胞（孢子）分离
选择培养基分离
传统选择性培养基
血平板：适于各类细菌的生长，一般细菌检验标本的分离，都应接种此平板。 巧克力血平板：其中含有V和X因子，适于接种疑有嗜血杆菌、奈瑟菌等的标 本。 中国蓝平板或伊红美蓝平板：可抑制革兰阳性细菌，有选择地促进G-菌生长， 是较好的弱选择性培养基。 麦康凯平板：具中等强度选择性，抑菌力略强，有较少革兰阴性菌不生长。 SS琼脂：有较强的抑菌力，用于志贺菌和沙门菌的分离。 碱性琼脂：用于从粪便中分离霍乱弧菌及其它弧菌。 血液增菌培养基：用于从血液、骨髓中分离常见病原菌。 营养肉汤：用于标本及各类细菌的增菌
微生物快速分离、计数方SUI)
微生物快速分离、计数方法
Compact Dry (NISSUI)
微生物菌种鉴定技术
细菌
真核生物
古菌
分类等级
界（Domain）
门（Phylum） 纲（Class）
科（Family） 属（Genus）
种（Species）
用于鉴定的生理生化特征
碳源和氮源 细胞壁组成
能源 发酵产物 一般营养类型 最适生长温度和范围 发光 能量转换机制 贮藏内含物
运动性 渗透耐性
氧关系 最适pH和生长范围 光合作用色素 盐需求及耐性 次级代谢产物形成 对代谢抑制剂和抗生素的敏感性
微生物菌种鉴定的问题
随着分类学的发展，微生物分类越来越多的以核 酸序列系统发育分析来建立新的分类单元和对原 有分类单元进行调整。 产生新的问题：将有越来越多的分类单元不能只 以表型特征进行鉴别，必须结合基因型测定才能 鉴定。
新型显色培养基：
利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应显色的原理来检测微生物 的培养基 。
微生物快速分离、计数方法
Petrifilm Plate (3M)
微生物快速分离、计数方法
3M Petrifilm Plate
Aerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform Count Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate
微生物菌种鉴定技术
1923(1)、1925(2)、1930(3)、1934(4)、1939(5)、1948(6)、1957(7)、 1974(8)、1994(9)
伯杰氏鉴定细菌学手册
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology
伯杰氏系统细菌学手册
Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 1984-1989(1)、2001-2010(2)
三界系统发育树
“种”微生物基本分类类群
微生物菌种鉴定技术
“种” 的定义：一个种（基因型种）是有相似 G+C组成并通过DNA杂交试验判断有70%或 更大相似性的菌株的集合。
表征分类 （Phenotic system ）
数值分类 （Numerical Taxonomy）
系统发育分类 （Phylogenetic）
方法冗长 结果不稳定 易污染
很多细菌不能 在土豆上生长
明胶高温易溶化 不能37°C培养