临床级干细胞分离培养
小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是骨髓中除造血干细胞外另一重要的干细胞。
MSC 具有自我更新、多向分化、免疫调控和支持造血的能力,而且来源广泛,容易在体外培养和扩增,目前已经应用于临床并显示了良好的治疗效果。
虽然MSC临床应用广泛,但许多关键问题如免疫调控的具体机制等并未解决。
小鼠是重要的实验动物之一,广泛用于基础实验研究。
在体外成功分离培养MSC,并得到大量纯化的MSC是研究其分化及功能调控机制的前提。
目前分离小鼠骨髓MSC的方法包括全骨髓贴壁法、骨片消化法、流式或磁珠分选法等。
然而全骨髓贴壁法获得的细胞往往含有不少造血细胞;骨片消化法需要进行胶原酶消化,步骤多且消化时问不好控制;流式或磁珠法虽然获得细胞较纯,但程序复杂,花费高且获得的细胞相对少。
骨髓MSC的分离目前常用的方法有全骨髓贴壁法、骨片消化法和流式细胞术或磁珠分选法。
全骨髓贴壁法即根据MSC的贴壁性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化MSC的目的。
然而该方法获得的MSC往往含有较多基质细胞和造血细胞污染。
我们的结果也显示,全骨髓贴壁法原代培养的细胞有75%为CD45阳性的细胞,传至第3代,MSC中仍有5%的CD45阳性细胞,即造血细胞。
骨片消化法,是先将骨髓冲干净,将股骨和胫骨剪碎,然后进行胶原酶消化。
虽然该方法获的MSC纯度较高,但是程序复杂,且不同鼠龄骨片胶原酶消化时间不同,不容易掌握。
随着对MSC表面抗原认识的深入,有研究者利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法对其进行分离纯化旧191;虽然这些方法可以得到纯度较高的细胞,但分离过程对细胞的活性影响较大,甚至导致细胞完全失去活性;而且实验条件要求高,需要骨髓量大,加之耗费较大和技术难度,在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。
本研究采用骨髓加骨片法分离小鼠MSC,即将股骨和胫骨肌肉去干净后,不需冲骨髓,不需消。
干细胞提取和培养的实用技巧和建议
干细胞提取和培养的实用技巧和建议干细胞是一类具有自我更新和多分化潜能的特殊细胞,对于生命科学研究和医学应用具有重大意义。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的基础工作,在实验室中有着重要的地位。
本文将给出一些关于干细胞提取和培养的实用技巧和建议,希望能对正在进行相关研究的科研工作者有所帮助。
一、干细胞提取的技巧和建议1.选择合适的样本:干细胞的来源多种多样,可以从胚胎、成体组织以及体液等多个渠道获取。
在选择样本时,需要根据自己的研究方向和实验要求来确定合适的来源。
同时,注意样本的获取方式需要符合伦理规范,尽量避免伤害动物或人体。
2.有效的细胞分离方法:干细胞通常以混合细胞群的形式存在于样本中,为了提取纯度较高的干细胞,需要采用有效的细胞分离方法。
常见的方法包括流式细胞术、磁珠分离和显微操纵等,选择合适的方法可以提高细胞分离的效率和纯度。
3.培养条件的优化:提取到的干细胞需要在体外培养中继续生长和扩增,为此,需要针对不同类型的干细胞优化培养条件。
确保培养基的成分和浓度适宜,相应的生长因子和细胞因子能够为干细胞提供必要的生长和分化信号。
4.维持干细胞的干性特性:干细胞的一个特点是具有自我更新和多向分化的能力。
在培养过程中,需要采取一系列措施来维持干细胞的干性特性。
例如,添加适量的抑制剂,调整培养基中的成分,以及维持细胞接触的方式等。
二、干细胞培养的技巧和建议1.培养器具和环境的准备:在进行干细胞培养前,需要对培养器具和环境进行彻底的清洁和消毒。
确保培养皿、培养箱和其他实验室设备无菌,避免细菌和霉菌等污染对干细胞生长的影响。
2.细胞传代的控制:在干细胞的长期培养中,细胞传代是不可避免的。
然而,过多的细胞传代会导致细胞老化和凋亡,影响干细胞的生理状态和功能。
因此,需要控制细胞传代的次数,同时选择合适的传代方法,以保持干细胞的长期稳定生长。
3.培养基的配制和补充:培养基的成分和浓度对干细胞的生长和分化起着重要的作用。
间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010110451.6(22)申请日 2020.02.21(71)申请人 广东国科细胞科技有限公司地址 510000 广东省广州市黄埔区(广州国际生物岛)螺旋四路一号生产区第二层201单元(72)发明人 陈海佳 陈东煌 戚康艺 姜交华 岳坤 (74)专利代理机构 北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人 温可睿(51)Int.Cl.C12N 5/0775(2010.01)(54)发明名称间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法(57)摘要本发明涉及干细胞培养技术领域,尤其涉及间充质干细胞的无血清培养基及间充质干细胞的临床级规模化培养方法。
本发明提供的间充质干细胞无血清培养基包括氨基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质,该培养基能够为细胞的生长、增殖提供充分的养分,更加适合MSCs无血清条件及高密度培养,从而获得良好的培养效果。
本发明还提供了一种补充因子,其包括激素及生长因子、贴壁因子、抗氧化成分、脂类、大豆胰酶抑制剂和大豆水解物。
该补充因子配合本发明所述的无血清培养基使用,能够保证在无动物源组分添加的情况下,干细胞能够快速增殖,且保持良好的干性。
权利要求书7页 说明书24页 附图3页CN 111440764 A 2020.07.24C N 111440764A1.间充质干细胞的无血清培养基,其特征在于,包括:氢基酸类、维生素类、无机盐类、pH缓冲剂、脂类、核酸类和其他物质;所述的氨基酸类包括:甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸;所述的维生素类包括:维生素C、生物素、氯化胆碱、泛钙素、叶酸、维生素B2、维生素B12、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、肌醇和烟酰胺;所述无机盐类包括:氯化钙、五水合硫酸铜、七水合硫酸铁、硫酸镁、硫酸锰、七水合硫酸锌、柠檬酸铁、氯化钠、氯化钾、氯化锂、丁酸钠、钼酸铵、六水合氯化镍、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠;所述pH缓冲剂类包括:碳酸氢钠和Hepes;所述脂类包括:亚油酸所述核酸类包括:腺嘌呤和胸苷;其他物质类包括:葡萄糖、腐胺、硫辛酸和丙酮酸钠。
临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范
DB32/T3544-2019临床级人体组织来源间充质干细胞质量控制管理规范1范围本标准规定了临床级人体组织来源间充质干细胞制备的基本要求、操作规范和质量控制。
本标准适用于临床级人体组织来源间充质干细胞的样本采集、制备、冻存、复苏与质量控制。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB3095环境空气质量标准GB19489-2008实验室生物安全通用要求GB50073-2001洁净厂房设计规范GB50346实验室建筑技术规范GB50591洁净室施工及验收规范WHO实验室生物安全手册(第三版)药品生产质量管理规范(卫生部令第79号)中华人民共和国药典(2015年版)干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则(试行)(国卫办科教发﹝2015〕46号)T11/CSSCR001-2017干细胞通用要求(中国细胞生物学学会-干细胞生物学分会团体标准)3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。
3.1临床级人间充质干细胞clinical grade human mesenchymal stem cells符合质量要求,可用于临床研究和应用的人多种组织来源(脐带血、脐带、胎盘、子宫内膜、脂肪、牙齿、骨髓等组织)间充质干细胞。
3.2伦理审查委员会ethical review committee负责对科学研究中涉及的伦理道德问题进行评估和审查的专门组织。
3.3科学审查委员会scientific review committeeDB32/T3544-2019负责对生物样本采集和使用的方案进行科学性审查的专门组织。
3.4生物安全委员会institutional biosafety committee负责制定生物安全政策和安全操作规范的专门组织。
3.5知情同意informed consent具有完全民事行为能力的自然人在重复获取信息并准确理解其内容后,作出接受或不接受样本采集的决定,此决定不受恐吓、利诱或其他不当行为的影响。
干细胞培养全攻略
干细胞培养全攻略第一步:准备工作在开始干细胞培养之前,您需要准备一些实验室必需品,如无菌培养器皿、培养基、培养药品和设备。
确保所有的培养物品都是无菌的,以防止任何细菌或真菌的污染。
第二步:细胞分离从组织或器官中获得干细胞是干细胞培养的第一步。
这通常需要对组织进行消化和分离,以获得细胞悬浮液。
消化的方法因组织类型而异,可以使用酶来消化组织,如胰蛋白酶、胶原酶等。
第三步:培养细胞将分离得到的细胞悬浮液培养在无菌培养器皿中。
干细胞可以在不同类型的培养基中生长,包括含有营养物质的基础培养基和添加了细胞生长因子和分化因子的特定培养基。
根据需要,可以选择不同的培养基来促进干细胞的增殖或分化。
第四步:细胞分化干细胞具有自我更新和分化为任何类型细胞的潜能。
要促使干细胞向特定细胞类型分化,可以通过添加特定的分化因子或调节细胞培养条件来实现。
例如,如果要将干细胞分化为神经细胞,可以添加神经生长因子到培养基中。
第五步:细胞鉴定和纯化在干细胞培养过程中,很重要的一步是对细胞进行鉴定和纯化。
这可以通过使用特定的标记物或抗体来检测细胞表面的分子标记完成。
例如,可以使用流式细胞术来分析细胞表面的特定蛋白,从而鉴定和纯化干细胞。
第六步:细胞传代干细胞通常需要定期传代以维持其生长和增殖。
细胞传代是将细胞从旧的培养皿中收集,并将其移植到新的培养皿中的过程。
在传代过程中,确保培养基和设备的无菌性以防止细菌和真菌的污染。
总结干细胞培养是一项复杂的技术,需要严格的实验操作和无菌技术。
在进行干细胞培养时,务必注意细胞的无菌性和培养条件的控制。
同时,在进行细胞分化和纯化时,要使用适当的试剂和方法来鉴定和纯化特定类型的细胞。
干细胞培养需要耐心和经验,但也为细胞生物学研究和医学应用提供了巨大的潜力。
干细胞提取方法与技巧
干细胞提取方法与技巧干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞,具有广泛的应用前景,被广泛研究和应用于生物医学领域。
为了有效地提取干细胞,研究人员发展了多种提取方法和技巧。
本文将介绍几种常用的干细胞提取方法及其相关技巧。
一、初级培养法初级培养法是一种常见的干细胞提取方法,适用于无需大量提取的情况。
该方法的步骤如下:1. 细胞准备:收集组织样品,将其分解为细胞悬液。
2. 培养基配制:根据所需提取的干细胞类型,选择适当的培养基并加入适量的细胞因子。
3. 细胞培养:将细胞悬液加入培养基中并进行培养,在适当的培养条件下促进干细胞分化与增殖。
4. 细胞分离:通过倒置显微镜观察,使用悬液中的细胞管控探测器将干细胞从其他细胞中分离出来。
5. 干细胞纯化:将分离出的干细胞用干细胞培养基培养并纯化,去除其他非干细胞杂质。
二、流式细胞术流式细胞术是一种常用的干细胞提取方法,利用细胞的免疫表型可以从复杂的细胞混合物中识别并分离干细胞。
其步骤如下:1. 细胞样品准备:提取组织样品并制备单细胞悬液。
2. 细胞标记:将单细胞悬液与特定的细胞表面标记物结合,可通过免疫磁珠或荧光标记等方法实现。
3. 流式细胞术分选:使用流式细胞术仪器进行细胞分选,根据标记物的不同发射光强度,将目标干细胞从混合物中分选出来。
4. 干细胞的检验与分离纯化:将目标干细胞从其他细胞中纯化出来,根据需要采取不同的分离纯化方法。
三、单细胞测序法单细胞测序法是一种快速有效的干细胞提取方法,可在单个细胞层面进行分析,帮助揭示不同类型干细胞的功能和特性。
其具体步骤如下:1. 单细胞捕获:通过微流控装置将单个细胞捕获和固定在特定位置。
2. 细胞裂解:采用细胞裂解酶对细胞进行裂解,释放出细胞内的RNA和DNA。
3. RNA/DNA扩增:使用逆转录酶和DNA聚合酶对捕获的RNA和DNA进行逆转录和扩增。
4. 测序准备:将扩增的RNA/DNA片段进行文库建立准备,包括文库构建、PCR扩增等步骤。
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法
原代骨髓间充质干细胞分离及提取方法骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是一种具有多向分化潜能的成体干细胞,广泛应用于组织工程、再生医学等领域。
原代骨髓间充质干细胞的分离和提取是进行相关研究的基础。
本文将详细介绍原代骨髓间充质干细胞的分离及提取方法。
一、实验材料1.骨髓样本:取自健康志愿者或实验动物(如大鼠、小鼠等)。
2.PBS缓冲液:磷酸盐缓冲液,用于细胞洗涤和分离。
3.胎牛血清:用于细胞培养。
4.抗生素:如青霉素和链霉素,用于细胞培养液中,防止细菌感染。
5.细胞分离液:如Ficoll分离液、Percoll分离液等。
6.细胞培养瓶、离心管、移液器等实验室常用器材。
二、分离方法1.骨髓样本采集:在无菌条件下,从志愿者或实验动物体内抽取骨髓,置于含有抗凝剂的离心管中。
2.骨髓细胞分离:将骨髓样本用PBS缓冲液稀释,然后缓慢加入细胞分离液,进行密度梯度离心。
离心后,收集界面层的细胞,即含有骨髓间充质干细胞的一层。
3.细胞洗涤:用PBS缓冲液洗涤细胞,去除残留的分离液和红细胞。
4.细胞计数:用细胞计数板对洗涤后的细胞进行计数,调整细胞浓度为合适的值。
5.细胞接种:将细胞接种于含有胎牛血清和抗生素的细胞培养液中,置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。
三、提取方法1.原代培养:将分离得到的骨髓间充质干细胞进行原代培养,待细胞生长至80%-90%汇合时,进行传代。
2.传代培养:将原代细胞用胰蛋白酶消化,然后按照1:2或1:3的比例进行传代。
传代后的细胞继续培养至所需细胞量。
3.细胞冻存:将提取得到的骨髓间充质干细胞进行冻存,以备后续实验使用。
4.细胞复苏:将冻存的细胞在37℃水浴中快速融化,然后用细胞培养液重悬,继续培养。
四、注意事项1.在实验过程中,严格遵循无菌操作原则,防止细胞污染。
2.骨髓样本的采集和处理应在抗凝条件下进行,以保持细胞活性。
3.选择合适的细胞分离液和离心条件,以提高骨髓间充质干细胞的分离纯度。
干细胞提取和分离方法总结
干细胞提取和分离方法总结干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型能力的细胞,因其在再生医学和疾病治疗方面的巨大潜力而备受关注。
干细胞的提取和分离是开展干细胞研究的关键步骤,本文将总结几种常用的干细胞提取和分离方法。
1. 胚胎干细胞提取和分离胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)具有广泛的分化潜能,可以分化为体内所有的细胞类型。
目前,主要有两种方法用于胚胎干细胞的提取和分离:体外受精和体细胞核移植。
- 体外受精方法:该方法从捐赠人体内获取受精卵,通过体外培养获得兔囊胚,并将兔囊胚的内质体提取出来,形成胚胎干细胞系。
这种方法可以大规模获取胚胎干细胞,但受到伦理等因素的限制。
- 体细胞核移植方法:该方法通过将一个成体细胞的细胞核移植到一个空卵子中,得到克隆胚胎。
然后从克隆胚胎中提取胚胎干细胞。
这种方法可以避免使用受精卵,但技术难度较大且效率较低。
2. 间充质干细胞提取和分离间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)存在于骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织中,具有自我更新和多向分化能力。
提取和分离间充质干细胞的方法主要有以下几种:- 骨髓采集法:该方法通过穿刺骨髓髓腔,用针收集骨髓组织,然后经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
这种方法具有高效、简便的优点,但操作有一定难度。
- 脐带血提取法:该方法通过脐带血采集脐带中的干细胞,经过干细胞分离和纯化得到间充质干细胞。
相较于骨髓采集法,脐带血提取法更为简单和无创,但提取的间充质干细胞数量和质量较低。
3. 诱导多能干细胞提取和分离诱导多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)是通过使用转录因子或化学物质将成熟的体细胞重新编程为干细胞的一种方法。
主要有两种方法用于诱导多能干细胞的提取和分离:细胞外基质和转录因子。
- 细胞外基质法:该方法在细胞培养基内添加适当的细胞外基质,提供合适的生长环境,帮助细胞重新获得干细胞特性。
干细胞的提取和培养方法介绍
干细胞的提取和培养方法介绍干细胞被广泛认为是生物学领域内最具潜力的研究对象之一,因其具备自我更新和多能分化的能力而备受科学家关注。
为了更好地理解干细胞在生物体内的作用和应用其潜力进行研究,有效的提取和培养方法是至关重要的。
本文将介绍几种常见的干细胞提取和培养方法,包括胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、成体干细胞和间充质干细胞。
胚胎干细胞(ESC)是最早被发现的一类干细胞,具有自我更新以及多能分化的特性。
提取ESC的方法通常是通过将内细胞团从早期胚胎中分离出来并将其培养在基质上,如鹅卵石胎盘或凝胶基质中。
内细胞团是胚胎早期形成的一层细胞,可以发展成各种不同类型的细胞,如肌肉、神经和心脏细胞。
随着科学技术的进步,科学家发现可以通过重新编程细胞来生成诱导性多能干细胞(iPSC)。
iPSC具有和胚胎干细胞相似的自我更新能力和多能分化能力,但不需要从胚胎中获得。
iPSC的提取方法主要包括细胞重新编程,即通过转导特定的基因或使用李斯特病毒进行基因转移,将成体细胞重新编程为干细胞。
成体干细胞是体内已分化的特定组织或器官中存在的干细胞。
这些干细胞具有自我更新和有限的分化能力。
成体干细胞可以从多种来源中提取,例如骨髓、脂肪组织和肌肉组织。
提取成体干细胞的方法通常是通过穿刺或手术获取组织样本,然后分离和培养出其中的干细胞群。
间充质干细胞是一类存在于成体组织中的多潜能干细胞,可以分化为多种类型的细胞,如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞。
间充质干细胞主要存在于骨髓、脐带血和脂肪组织中。
提取间充质干细胞的方法主要通过采用骨髓穿刺、脂肪组织切割或脐带血采集等操作,然后将提取到的细胞进行培养和扩增。
无论是胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞还是间充质干细胞,提取和培养方法都需要遵循一些基本原则。
首先,细胞提取过程应该尽量避免对细胞的损伤,以确保细胞的完整性和功能。
其次,培养环境应提供适当的营养物质、生长因子和细胞外基质,以促进干细胞的增殖和分化。
骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法
骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养鉴定方法主要包括以下步骤:**一、分离方法**1. **差速贴壁法**:利用BMSCs与骨髓中其他细胞的贴壁性能差异及酶消化敏感性差异进行分离。
这种方法快速、简单、经济,但细胞纯度可能相对较低。
2. **密度梯度离心法**:基于骨髓中不同细胞的大小和密度差异进行分选。
通过流式细胞术检测,细胞表面抗原表达CD105,CD73和CD90必须≥95%,同时表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α,或CD19和HLA - DR必须≤2%。
**二、培养方法**培养BMSCs的难点在于保持细胞活性。
不同种属来源的BMSCs在体外培养扩增方法基本相似,但细微的营养条件、培养环境等差异都将会对细胞性能产生影响。
**三、鉴定方法**1. **细胞形态学观察**:利用组织块贴壁法、酶消化法或其结合来分离MSC,并通过传代培养进行形态学观察。
几乎所有的MSC都是贴壁生长,具有较强的贴壁能力。
MSC多数呈纤维细胞样生长,少量呈梭形或不规则三角形。
2. **表面标志物鉴定**:采用流式细胞仪对MSC的细胞表型进行鉴定。
MSC的表面抗原具有非专一性,可以同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志,如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。
MSC的细胞表面标志物鉴定标准为:CD105、CD73和CD90的阳性率≥90%;而CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR 呈阴性,阳性率≤5%。
综上所述,骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定是一个复杂的过程,涉及多个步骤和专业的技术操作。
在进行这些操作时,需要严格遵守实验规程,确保实验的准确性和安全性。
同时,对实验结果的解读也需要具备一定的专业知识和技能。
干细胞分离培养
2. 干细胞分离培养2.1胚胎干细胞诱导分化首先将类胚体消化成单细胞,贴壁培养,于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件,直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞;或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用,从而高效诱导目的细胞的分化。
改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种:一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等;二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养;三是将细胞接种在适当的底物上,以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降,从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。
体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因子诱导法和外源基因诱导法。
化学试剂诱导法:维甲酸(RA)、DMSO、β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2,5-羟基维生素D3等化学试剂,都能诱导ES 细胞定向分化为特定类型细胞。
细胞因子诱导法:ES细胞在培养过程中对许多细胞因子具有很强的依赖性。
增加或减少一种或几种细胞因子可影响ES细胞的增殖或分化。
目前研究最深入的细胞因子主要有骨形成蛋白(BMPs)和成纤维细胞生长因子(FGF)等。
外源基因诱导法:转基因法可以弥补细胞因子法的不足。
其原理是使某个促分化基因在ES细胞中过度表达,从而调控ES细胞的分化。
应用此方法之前,首先要确定决定该细胞向不同方向分化的关键基因,其次还要确保在适宜的时间将此基因正确插入到ES细胞基因组序列上。
2.2肿瘤干细胞(CSC)分离鉴定对于CSC的分离纯化主要有根据细胞表型特征和生物学特性而建立的两大类方法:第一类:依赖于细胞表面标志的分离方法造血系统肿瘤干细胞:正常造血干细胞的表型为CD34+CD38+Thy-1-实体瘤肿瘤干细胞:A.乳腺癌:ESA+CD44+CD24-/LowLineage-的细胞是乳腺癌CSC。
B.脑肿瘤:将CD133+的肿瘤细胞命名为脑肿瘤干细胞(BTSC), 还表达Sox2、Musashi-1、bmi-1、磷酸丝氨酸磷酸化酶等神经干细胞和其它干细胞的基因特征C.结直肠癌:CD133+细胞是结直肠癌细胞的起始细胞。
干细胞提取和培养的操作技巧分享
干细胞提取和培养的操作技巧分享干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞,具有重要的生物学和医学研究价值。
干细胞的提取和培养是干细胞研究的重要环节,操作技巧对于获得高质量的干细胞至关重要。
在本文中,我将与大家分享一些干细胞提取和培养的操作技巧,希望能对广大科研工作者有所帮助。
一、干细胞的提取技巧1. 选择合适的组织来源:干细胞的提取来源有很多种,如胚胎、胎盘、脐带血、骨髓等。
在选择组织来源时,需要考虑到干细胞的种类与目标研究的需求,以及提取的难度和伦理道德问题等方面因素。
2. 提取方法的选择:干细胞的提取方法有多种,如机械分离、酶消化、磁珠分离等。
在选择提取方法时,需结合组织来源的特点和研究需求进行评估,并优化提取步骤以提高干细胞的纯度和活力。
3. 组织处理和细胞分离:对于一些组织样本,需要进行前处理步骤,如组织粉碎、胶原酶等酶消化处理。
之后,通过离心等方式将细胞分离出来,将干细胞与其他细胞分离开来。
4. 干细胞单克隆的建立:在提取的细胞中,可以通过单克隆化方法建立纯种的干细胞克隆。
单克隆的建立有助于获得高质量的干细胞群体,为后续的研究提供可信的实验样本。
二、干细胞的培养技巧1. 培养基的选择:干细胞的培养基的选择直接影响到细胞的生长和分化。
不同类型的干细胞具有不同的培养基需求,常用的培养基有无血清培养基(serum-free medium)、DMEM/F12培养基等。
在选择培养基时,需综合考虑细胞的生长特性、细胞需求的添加物和研究目的等因素。
2. 培养条件的控制:干细胞的培养需要控制适宜的温度、湿度和气氛等条件。
常见的培养温度为37℃,湿度需要保持适宜的水分,而气氛通常是5%CO2和95%空气的混合气体。
保持恰当的培养条件有助于干细胞的健康生长和维持干细胞状态。
3. 培养基和培养器具的消毒:在干细胞的培养过程中,保持培养基和培养器具的无菌状态是非常重要的。
所有使用的培养器具和培养基应经过严格的消毒处理,以防止有害细菌或真菌的污染。
干细胞临床研究治疗资料
干细胞临床研究治疗资料干细胞治疗适应症:1、干细胞移植治疗神经系统疾病如:脑瘫、脊髓损伤、运动神经元病、帕金森病、脑出血、脑梗塞后遗症、脑外伤后遗症等;2、干细胞移植治疗免疫系统疾病如:糖尿病、皮肌炎、肌无力、血管病变、硬化病、白血病等;3、干细胞移植治疗其他疾病:如肝病、肝硬化、股骨头坏死等;干细胞功能作用:重建系统利用造血干细胞移植既可重建造血系统;又可重建免疫系统重建系统;目前是白血病、淋巴瘤、再生障碍性贫血等恶性和非恶性血液病以及部分免疫系统缺陷疾病的一种成熟常规的治疗手段..细胞替代治疗利用间充质干细胞、心肌干细胞等成体干细胞、iPS细胞进行神经系统疾病、心脏疾病、糖尿病、肝病等疾病治疗;技术尚未成熟;干细胞移柱时间、细胞数量以及移植后长期安全性仍需探索..组织工程体外以干细胞为种子细胞培育成一些组织器官;用来替换人体衰老和病变的组织器官;组织和器官同时也可作为药物检测平台和疾病模型;距离治疗性人体器官克隆仍有很多关键性问题尚待解决..基因治疗干细胞是基因治疗的理想靶细胞;为目的基因持续稳定表达创造条件;用于临床尚有许多难以突破困难;如何在提高基因转移效率;使基因持久表达的同时防止基因整合所致的癌变;疗效仍不肯定..国际干细胞研究发展随着干细胞基本原理和相关技术的成熟和更新;以及监管政策的不断转暖;各国已纷纷加快干细胞的临床研究;列入国家科技的战略必争领域..据统计;全球约近100多个重要干细胞研究中心;美国和加拿大有50个先进中英国大约有20个;欧洲其他地区大约25个;亚太地区约30个中心主要在韩国及日本在国际干细胞研究领域;美国一直保持着绝对领先的地位;;美国一直大力支持包括成体千细胞在内的千细胞研FDA至今己批准数百个千细胞临床应用研究..欧洲和亚洲国家也纷纷加快干细胞各个层次的研究;英国药品与保健产品监管局MHRA 己许可针对视网膜黄斑变性开展干细胞人体治疗试验;以色列Pluristem公司最先宣布基于其人胎盘来源贴壁细胞专利技术治疗重度下肢缺血症的药物PLX-PAD已在德国进入临床试验;日本从2000年即启动的“千年世纪工程”;将干细胞工程作为四大重点之一;并在诱导性多能干细iPS领域处于世界领先地位;..印度药品管理局早先即批准了干细胞产品的第一个临床试验..根据美囯囯立卫生研究院管理的临床研究登记系统C| inicaltria|sgov数据显示;截止至2016年5月;全球登记的干细胞临床研究项目共5496项主要是成体千细胞临床试验;涉及血液病、肿瘤、神经系统疾病、心脏疾病、免疫系统疾病等领域;其中美国保持绝对领先的地位;德国、法国等欧洲国家紧随其后;在亚洲;中、韩、日三国也是干细胞研究的热点地区..全球共批准8个干细胞药物;中国并未在其列..中国干细胞临床研究备案机构102家;河北省4家..国家卫计委官方备案的干细胞临床研究项目:1.脐带间充质干细胞移植治疗狼疮性肾炎的临床研究—大连医科大学附属第一医院2.自体外周血干细胞治疗糖尿病性皮肤病的临床研究—大连医科大学附属第一医院3.带间充质干细胞/神经干细胞治疗小儿脑性瘫痪的临床研究大连医科大学附属第一医院4.脐带间充质干细胞联合脐血干细胞治疗外伤性脊髓损伤胞联合脐血干细胞治疗外伤性脊髓损伤—中南大学湘雅医院5.脐带间充质干细胞联合脐血干细胞治疗脊髓小脑性共济失调—中南大学湘雅医院6.临床级人胚胎干细胞来源的神经前体细胞治疗帕金森病—郑州大学第一附属医院7.临床级人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗视网膜色素变性—郑州大学第一附属医院8.临床级人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗干性年龄相关性黄斑变性—郑州大学第一附属医院9.自体骨髓“间充质干细胞心梗注射液”移植治疗急性心肌梗死的随机、双盲、安慰剂对照、多中心临床试验—中国医学科学院阜外医院10.人自体支气管基底层细胞治疗间质性肺病临床研究—上海市东方医院同济大学附属东方医院11.人脐带间充质干细胞治疗心衰的临床研究—上海市东方医院同济大学附属东方医院12.评价异体脂肪来源间充质祖细胞治疗膝骨关节炎安全性和有效性的单中心、随机、双盲的Ⅰ期临床研究—上海交通大学医学院附属仁济医院13.脐带源间充质干细胞治疗视神经脊髓炎谱系疾病的前瞻性多中心随机对照研究—上海交通大学医学院附属仁济医院14卵巢早衰合并不孕症患者脐带间充质干细胞移植干预的临床研究南京大学医学院附属鼓楼医院、15、卡泊三醇+银屑灵优化方联合脂肪原始间充质干细胞治疗中重度寻常型银屑病的随机双盲对照试验广东省中医院干细胞临床治疗最新进展:1、干细胞治疗脱发;减少疤痕2、干细胞开启了脊髓损伤治疗的新大门3、干细胞疗法治疗黄斑退化5.干细胞疗法能够修复更年期的过早出现以及生育问题6.首次证实人神经干细胞移植可改善脊髓损伤猴子的抓力7.揭示SMAD2/3协调人多能性干细胞发育8.利用牙龈中的间充质干细胞来加速伤口愈合9.神经干细胞再生的机制10.中国开展全球首个人类受精胚胎干细胞治疗帕金森病临床试验11.日本批准利用供者干细胞开展治疗老年黄斑变性的临床试验12.干细胞疗法治疗创伤性脑损伤已通过初步临床试验13.干细胞治疗肝脏疾病14.首个临床试验科学家利用异体造血干细胞来治疗阿尔兹海默氏症15.靶向癌症干细胞临床新药获美国FDA突破性疗法认定16.临床试验证明干细胞疗法治疗“渐冻症”的安全性解救“渐冻人”有望落实行动17.全球首次子宫中干细胞疗法临床试验即将开展18.英科学家用间充质干细胞培育出人类骨骼19.间充质干细胞和造血干细胞共同移植可减轻移植物抗宿主病20.类风湿性关节炎的间充质干细胞治疗21.利用黑科技“组合拳”刺激间充质干细胞;解决骨折不愈合22.间充质干细胞治疗慢性肺疾病进展23.间充质干细胞——癌症基因疗法的新视野24.间充质干细胞外泌体——未来更理想的肝病治疗工具25.治疗中风;间充质干细胞或有办法26.间充质干细胞治疗神经退行性疾病;结果喜人27.间充质干细胞治疗脊髓损伤:坐轮椅14年;奇迹站起来。
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法分类
分离培养干细胞的方法主要可以分为以下几类:
1. 最常见的方法为机械分离法,利用组织或细胞的物理性质进行分离。
例如在骨髓中分离造血干细胞时,可以利用胶体或其他分离物质将骨髓细胞进行分层,然后将不同层次的细胞进行分离。
2. 免疫选择法,利用单克隆抗体的特异性结合,将目标细胞从混合细胞中分离出来。
例如在胎盘组织中分离胚胎干细胞时,可以利用特异性的单克隆抗体识别胚胎干细胞表面的记号分子,然后利用磁性微珠等手段将这些细胞分离出来。
3. 化学处理法,利用化学或药物物质的特性,直接或间接地影响目标细胞的生长与分裂。
例如在胚胎干细胞的培养中,可以利用衍生自自然化合物的小分子化合物,来调控细胞的生长与分裂。
4. 细胞团块培养法,利用干细胞的自我复制和自我更新的特点,在培养基中形成球状细胞团,然后分离出内部细胞团中的干细胞。
例如在胚胎干细胞的分离中,可以将早期发育阶段胚胎的内细胞团分离出来进行培养。
以上是几种干细胞分离与培养方法的分类和简要介绍。
深入了解细胞培养基产品类型及其定义
在细胞治疗应用的领域中,培养基属于重要的辅助性材料之一,因此,了解细胞培养基(culture media)的分类及定义对于细胞治疗产业显得格外重要,尤其要符合细胞治疗应用的培养基常属于无血清的培养基(serum-free media)。
培养基也因为要符合法规面的要求,培养基的生产最好能也符合GMP的规范,因此大部分细胞治疗公司所使用的培养基都是购自有能力生产临床等级培养基的供应商,如环凯生物。
而常被应用于细胞治疗的细胞类型包含免疫细胞及干细胞,而这些供应商大部分都有自行研发的能力并可生产出专门培养免疫细胞或干细胞的培养基,当然,用于生产培养基的成分及用量通常属于机密,所以使用者一般无法得知培养基内含有的所有成分及成分的来源属性,且不同供应商所生产的培养基常常用不同的名词(term)来描述产品,这很容易让造成使用者的混淆,或是供应商自己误用了这些术语,常常同样的term在不同的供应商则各自有不同的认定及解读,也有一些公司可能因为有商业上的考量,因此用含的术语常常让人混淆不清,导致这些状况的出现主要是目前世界上并没有公认的第三方机构来定义这些名词及术语,有可能在美国、欧洲及亚洲对于同样地名词有着不同的解读,也因为这些原因,对于细胞治疗的开发者是必须有责任去厘清并了解这些供应商对于其产品所标示或描述的名词所代表的意义,以确保该细胞治疗产品的品质。
图. 用于说明细胞培养基分类的示意图:以血清为主(SB),无血清(SF),不含异种(XF),无动物成分(ACF),无蛋白质(PF)和化学定义(CD)。
♦无血清培养基通常含有纯化的蛋白质,其蛋白可能源于动物或人类,并可能与其他确定和未确定的成分有关联。
♦含有纯化人类的培养基、蛋白质和或人血小板裂解物是无血清和无异种的。
♦无动物成分的培养基不含人和动物来源的成分,通常含有植物水解物。
♦化学成分确定的培养基通常由人重组蛋白质组成。
♦不含蛋白质的培养基不含蛋白质,但通常包含水解蛋白质和不明确的天然脂质。
间充质干细胞临床应用的安全性问题
间充质干细胞临床应用的安全性问题作者:武艳曹雅男刘洁婷袁晓环腾云来源:《中国当代医药》2014年第32期[摘要] 间充质干细胞是干细胞家族的重要成员,起源于中胚层和外胚层,因其具有易分离、趋化性、免疫调节作用、多向分化潜能等生物学特性而日益受到人们的关注,并成为细胞疗法中治疗各种难治性疾病的热门种子细胞,然而细胞疗法所涉及的潜在风险还不确定。
本文就间充质干细胞应用所涉及的安全性问题作综述,并强调建立规范化的应用标准更有利于细胞产品在临床上的应用和推广,给广大患者带来真正的福音。
[关键词] 间充质干细胞;细胞疗法;安全性[中图分类号] R457.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2014)11(b)-0190-03细胞疗法近年来已成为治疗多种疾病的新策略,其目的是替代修复或加强受损组织和器官的生物学功能。
随着干细胞生物学与再生医学研究的深入,人们对于其生物学特性及潜在的临床应用认识逐渐加深,使之成为细胞疗法中应用最多的靶细胞[1-3]。
随着对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)认识的逐步深入,其自身的优越性逐渐显露出来,将成为细胞替代治疗的理想种子细胞。
对于MSCs研究的某些成果已开始应用于临床,有一些虽然暂时未能在临床上开展,但也为有些疾病的临床治疗提供了新的治疗角度和思路。
对于MSCs治疗作用的评估最开始是在再生医学的应用上,MSCs已经显示出具有直接调节先天性与适应性免疫系统的作用[4]、促进上皮细胞增殖[5]、促进缺血性组织的血管再生等等[6],MSCs的这些特性发现开启了MSCs移植治疗免疫性、组织损伤性等疾病的新纪元。
近年来,对一些难治性疾病采用MSCs移植治疗已经得到美国食品和药物管理局(US-FDA)的批准,包括心肌梗死、脑卒中、半月板损伤、移植物抗宿主病及自身免疫紊乱性疾病等[7]。
尽管在过去的十几年中,临床试验很少发现MSCs移植会产生不利的影响,但在动物实验则发现可能存在较短时间内未发现潜在性的危害,本文将MSCs移植涉及的安全性问题作总结。
临床级细胞库建立标准
临床级细胞库建立标准临床级细胞库建立标准1.细胞来源控制细胞库的建立首先需要确保细胞的来源可靠且符合法律法规。
所有用于临床级细胞库的细胞应来自经严格认证的合法供体,并且应尽可能遵循无菌、无致癌物质和无其他有害物质的准则。
对于涉及人类组织和器官的细胞来源,应遵循伦理和道德原则,并获得相关伦理委员会的批准。
2.细胞质量标准为确保细胞的稳定性和安全性,需制定严格的质量控制标准。
这些标准应包括细胞的纯度、活力、数量、分裂能力、无菌性、支原体以及特定病原微生物检测等。
细胞应具备稳定的遗传背景,无致瘤性,并对各种刺激因素无过度反应。
在细胞培养过程中,应定期进行质量控制检查,以确保细胞库的细胞持续符合这些标准。
3.细胞培养条件细胞培养环境对细胞的生长和分化具有重要影响。
培养条件应包括适当的温度、湿度、气流、二氧化碳浓度以及无菌环境等。
同时,培养基和添加因子应满足细胞的营养需求,并防止细胞在培养过程中受到物理、化学或生物等因素的不良影响。
为保证细胞的稳定生长和繁殖,应定期监测和调整培养条件。
4.细胞传代与扩增为确保细胞的稳定性和可重复性,细胞库的细胞应采用标准化方法进行传代和扩增。
传代过程中应遵循无菌操作原则,并及时去除死细胞和污染物。
扩增过程应严格控制细胞的分裂和生长速度,以维持细胞的稳定状态。
为保证细胞的遗传稳定性和表型特征,应限制细胞的传代次数,并记录详细的细胞传代和扩增信息。
5.细胞冻存与复苏为长期保存细胞库的细胞,需采用冻存技术。
冻存过程中应选择适合的冷冻保护剂,并严格控制降温速度,以防止细胞内冰晶形成导致细胞损伤。
复苏过程中应缓慢加入冷冻保护剂,并逐步提高温度,以最大程度地保留细胞的活力和特性。
为保证细胞的存活率和稳定性,应定期进行冻存和复苏实验,并记录详细过程。
6.细胞鉴定与标记为确保细胞库中细胞的种类和来源清晰可辨,应对每种细胞进行鉴定和标记。
这可以通过形态学、免疫学、分子生物学等方法实现。
此外,为防止交叉污染,应对不同种类的细胞进行物理隔离或标记特殊的识别标志。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
临床级干细胞分离培养等产业化关键技术研发
一、项目背景和意义:
作为生物技术最新的研究领域,干细胞的发现和干细胞技术的发展为人类疾病的治疗提供了独特的视角、方法和手段,为人类疾病治疗提供了新的希望和曙光,必将引起一场医学的革命。
干细胞的重要性奠定了其在医药卫生、科技产业和国防等领域内的重要地位,因此干细胞的研究开发和应用是人类的健康工程,预期在未来几年内会有更大的飞跃。
尤其是近年来,干细胞研究的进程和产业化速度大大加快。
干细胞的产业化是指依托于干细胞采集、储存、研发、移植、治疗等产品或服务以满足人类各种治疗和应用目的的行业种类的总称,干细胞产业已成为一个生机无限的经济增长点,蕴含着巨大的利润空间,是21世纪最有前景的朝阳产业。
临床级干细胞的分离与扩增是干细胞产业化过程中的重要环节。
什么样的干细胞能从体外培养进入临床疾病治疗?这就需要建立一个临床级干细胞的标准,它可以极大促进干细胞临床疾病治疗的研究和发展。
目前干细胞治疗研究中开展最广泛的两类细胞是造血干细胞和间充质干细胞。
对于造血干细胞,目前全世界已经建立了很多脐带血库来保存造血干细胞,并已得到广泛的应用。
而间充质干细胞的建库和临床应用才刚刚起步,目前已初步应用于治疗血液病(与造血干细胞共移植)、心脏病、脊髓损伤和多种自身免疫性疾病等,并取得了一定进展。
在间充质干细胞治疗同种异基因造血干细胞移植后发生
的GVHD方面,美国Osiris公司已完成了III期临床试验。
间充质干细胞具有广泛的应用前景,但是,迄今为止仍没有一个国际公认的能够用于分离和鉴定间充质干细胞的表面标志,这造成了制剂细胞成分不均匀、质量难以控制等困难。
因此,开发特异性分离间充质干细胞的新方法是进一步推动间充质干细胞临床应用的必然趋势。
按照临床应用的标准开发骨髓、脂肪、脐带等间充质干细胞的特异性分离纯化工艺,建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序对于间充质干细胞的未来应用具有重大的推动作用。
二、项目目标
1. 总体目标:
建立临床级干细胞标准、开发临床级干细胞分离与培养工艺以及建立临床用间充质干细胞的制备工艺技术标准程序等。
2.具体技术指标:
建立1项成体干细胞的临床级分离纯化的关键技术、标准化操作程序和质控标准,实现间充质干细胞治疗产品生产的标准化、规模化运行,质量达到临床应用标准。
三、主要研究内容:
针对干细胞临床应用中所面临的分离、培养、扩增等关键问题,重点确定与国际接轨的临床级干细胞的标准,建立多种临床级干细胞
的分离纯化和培养新技术,为实现干细胞产业化奠定基础。
1.临床级干细胞的标准研究
参照ISSCR《干细胞临床转化指南》等国际文件,主要从以下要点进行临床级干细胞标准的研究:
1)符合卫生部门对治疗技术的标准和管理;
2)符合ISSCR《干细胞临床转化指南》中干细胞应用于临床的国际性考量;
3)符合国际细胞生物学界对干细胞科学标准的共识;
4)干细胞制备符合药品生产制备标准包括质量控制平台和cGMP平台等;
5)依照ISO9001:2008标准,制定干细胞标准化质量管理体系,涵盖干细胞的保存/运输等环节,标准化流程、文档及相应标准电子化管理与实时监控系统。
2.研发不同来源间充质干细胞的特异性分离纯化技术
1)建立临床级间充质干细胞的制备技术标准程序;
2)评价临床级间充质干细胞遗传稳定性和安全性;
3)评价临床级间充质干细胞的生物学效力。
四、建设地点
五、经费概算
六、承担单位
和泽生物科技有限公司为中国最大的干细胞投资控股企业,公司注册资本3.25亿元。
公司与中国医学科学院血液学研究所等单位共同投资组建的协和干细胞基因工程有限公司和协和华东干细胞基因工程有限公司是生物医药类的国家重点扶持高新技术企业,同时也是国家干细胞工程产品产业化基地。
公司以干细胞工程技术为重点研究方向,主要开展人干细胞的分离、纯化、体外扩增和无血清化技术的研究;建立集约化、系统化干细胞工程产品研发与生产技术;开展细胞制剂的研究开发和细胞株系筛选以及开发人干细胞无血清培养基和配套诊断试剂的技术;开展临床适用型干细胞扩增技术研究、干细胞大规模储存技术研究、优化和完善干细胞分离纯化、生物学和微生物检测、HLA配型、深低温冻存与复苏及移植应用技术;研究制定干细胞培养、产品储存、运输、移植等操作规程和标准。
其中脐带MSC是中源协和干细胞生物工程股份公司主力开发的细胞产品,已进行了大量前期研究工作。
公司实验室设备先进齐全,并拥有上市公司提供充沛的资金支持和优秀的风险管理团队,完全具有承担该研究的能力。