中华血液学杂志

材料和方法
1 材料和主要试剂 HL260 细胞引自湖南医科大学肿瘤研 究所 ,培养于含 10 %的热灭活小牛血清 (杭州四季青公司) 、 100 U/ ml 青霉素及 100 U/ ml 链霉素的 RPM I 1640 培养基 ( Gibco 公司产品) 中 ,在 37 ℃,5 % CO2 的培养箱内培养传 代 。DADS 为 Fluka 公司产品 ,相对分子质量为 146. 28 ,纯度 为 80 % [ 含 10 %～20 % 二烯丙基硫醚 (DAS) ] 。DADS 与 Tween80 以 1∶2 的比例充分溶解后 ,加入生理盐水稀释 100 倍 ,保存于 - 20 ℃冰箱中 。全反式维甲酸 (A TRA) 、佛波酯 ( TPA) 、硝基 四 氮 唑 蓝 ( NB T) 、纤 维 蛋 白 原 和 凝 血 酶 均 为 Sigma 公司产品 ; FITC 标记的 CD11b鼠单克隆抗体 (单抗) 购 于北京中山生物技术有限公司 。 2 DADS 对人白血病细胞生长的抑制作用 采用噻唑蓝还 原法 (M T T 法) 测定[1 ] ,取对数生长期细胞 ,调细胞浓度为 3 ×104/ ml ,将 100μl 细胞悬液置 96 孔培养板中 ,实验设为 10 组 。1～6 组为不同浓度 (0. 625 ,1. 25 ,2. 5 ,5. 0 ,10. 0 ,20. 0 μg/ ml) DADS ;7 组为试剂对照 ( RPM I 1640) ; 8 组为肿瘤细 胞阴性对照 ; 9 组为 A TRA 对照 ; 10 组为溶媒对照 ( Tween 80) 。每组 8 个复孔 。置 37 ℃,5 % CO2培养箱中培养 24 ,48 和 72 h ,进行 M T T 检测 。以试剂对照组调零 ,测波长 570 nm 吸光度 ( A ) 值 。按公式 : 细胞生长抑制率 ( %) = ( 1 A 实验组/ A 对照组) ×100 %计算各浓度组的抑制率 。以上实验 各重复 3 次 ,求平均值 。 3 细胞分化检测 将对数生长期细胞以 1 ×104/ ml 的细胞 浓度接种于 96 孔板中 ,200μl/ 孔 。 3. 1 NB T 还 原 法 检 测 : 分 别 加 入 不 同 浓 度 DADS 和 Tween80 、溶剂 ( RPM I 1640) 、A TRA 对照 ,并设空白对照组 。
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> 0. 05) ,自 48 h 起呈时间依赖性增加 ,且在 0. 625～1. 25 μg/ ml 时呈剂量依赖性增加 ; 浓度 > 1. 25 μg/ ml 时 ,随浓度 增加 ,NB T 还原能力下降 ; 1. 25 μg/ ml 为峰值 ( P < 0. 01) 。 1. 25μg/ ml DADS 与 A TRA 比较差异无显著性 ( P > 0. 05) 。 Tween80 组与对照组比较差异无显著性 ( P > 0. 05) (表 2) 。
3 DADS 对 细 胞 表 面 分 化 抗 原 的 影 响 经 1. 25 μg/ ml DADS 和 A TRA 处理 HL260 细胞 3 d ,CD11b表达明显升高 , 由未加药物处理时的 12 %分别增加到 44 %和 43 % ,与对照 组比较差异均有显著性 ( P < 0. 01) ,DADS 与 A TRA 比较差 异无显著性 ( P > 0. 05) 。而经 Tween80 处理的 HL260 细胞 , CD11b的表达只有 10 % ,与对照组比较无显著性差异 ( P > 0. 05) 。 4 DADS 对小鼠肾囊膜下 HL260 细胞的生长抑制作用 如 表 3 所示 ,各实验组的抑瘤率与生理盐水对照组相比差异均 有显著性 ( P < 0. 05) ,且 DADS 各组的抑瘤率随剂量的增加 而升高 ,DADS 在 21 mg/ kg 时的抑瘤率达 49. 5 % ,与 A TRA 的抑瘤率相似 , 差异无显著性 ( P > 0. 05) 。各组给药后小鼠 的体重 、毛色均无明显不良变化 。 5 DADS 对小鼠肾囊膜下 HL260 细胞的诱导分化作用 DADS 在 21 mg/ kg 时 ,肾囊膜下 HL260 细胞形态呈分化现 象 ,可诱导 HL260 细胞向成熟粒细胞分化 ,细胞胞体明显缩 小 ,胞核凹陷 ,呈肾形 、杆状或分叶状 ,核浆比例明显缩小 ;当 DADS 浓度增加到 42 mg/ kg 时 ,细胞形态既有分化又有坏
结果
1 DADS 对 体 外 培 养 的 HL260 细 胞 生 长 的 抑 制 作 用 DADS 作用的 50 %细胞生长抑制浓度 ( IC50) 为 3. 94 μg/ ml 。 从表 1 可见 DADS 对 HL260 细胞的生长抑制与药物浓度有 明显依赖关系 ,DADS 从 0. 625μg/ ml 增至 20. 0μg/ ml ,其对 HL260 细胞的生长抑制率由 18 %增至 70 %。各实验组随时 间增加抑制效率明显增加 。经方差分析 , DADS 在不同浓 度 ,不同时间 ,细胞生长抑制率组间差异有显著性 ( P < 0. 01) 。Tween80 组与各浓度组之间比较差异有显著性 ( P < 0. 01) 。A TRA 与 1. 25 μg/ ml DADS 相比差异无显著性 ( P > 0. 05) 。 2 DADS 对 NB T 还原能力的影响 DADS 对 HL260 细胞 NB T 还原反应阳性率 24 h 与对照组相比差异无显著性 ( P
基金项目 :湖南省卫生厅科研基金资助项目 (00068) 作者单位 :421001 湖南省衡阳市 ,南华大学医学院肿瘤研究所 (武明花 、黄卫国 、苏琦) ;衡阳市铁路医院肿瘤内科 (唐黎) ;湖南省株 州市中心医院妇产科 (李利平) 通信作者 :苏琦
分别培养 1 ,2 ,3 ,4 d 后 ,测定处 A 570值 。 3 . 2 流式细胞仪测定 :将不同浓度 DADS 及 A TRA 处理的 细胞 (1 ×105/ ml) 培养 3 d ,离心收集细胞 ,用 FITC 标记的 CD11b鼠单抗进行标记 ,进行流式细胞仪检测 。 4 DADS 对小鼠肾囊膜下 HL260 细胞生长抑制和诱导分化 作用 4 . 1 小鼠的预处理及 HL260 细胞接种 : 昆明种封闭群小鼠 (由本校实验动物中心提供) 40 只 ,体重约 27～33 g ,腹腔注 射环磷酰 胺 ( 150 mg/ kg) , 进 行 预 处 理 。取 对 数 生 长 期 的 HL260 细胞 ,调细胞浓度为 4 ×106/ ml ,加入纤维蛋白原工作 液 200μl 混匀 ,再加入凝血酶工作液 100μl ,使之成为细胞凝 块 ,并将其切成等体积的小块 。麻醉状态下将凝块插入 1 d 前预处理小鼠左侧肾囊膜下 。 4 . 2 接种 HL260 细胞的小鼠分组及给药 :将动物随机分为 5 组 , 每 组 动 物 数 为 8 只 。DADS 组 设 21 , 42 , 84 mg/ kg DADS 三个剂量组 ,不同剂量组用生理盐水稀释成所需浓 度 ,阳性对照组用 A TRA 11 mg/ kg ;空白对照组用生理盐水 。 采用鼠尾静脉注射 ,于接种次日给药 ,连续 5 d 。第 6 天处死 小鼠 ,在解剖显微镜下测量肿瘤长 、短径 。肿瘤体积 = 长径 ×短径 ×短径/ 2 ,抑瘤率 ( %) = (对照组瘤体积 - 用药组瘤 体积) / 对照组瘤体积 ×100 %。 4 . 3 形态观察 :将荷瘤肾在 10 %的中性甲醛中固定 24 h ,石 蜡包埋 ,切片 ,苏木精2伊红染色 ,光学显微镜下观察细胞形 态变化 。 5 统计学方法 采用 SPSS 10. 0 统计学软件进行结果处 理 ,实验组与对照组比较用 t 检验 。组间比较采用四格表χ2 分析 。
DADS( mg/ kg) 21 42 84
A TRA 11 mg/ kg
8 27 ±2 27 ±2 5. 73 ±0. 84 0
8 28 ±2 28 ±2 2. 89 ±0. 23 49. 5 8 29 ±2 29 ±2 2. 63 ±0. 57 56. 9 8 28 ±2 28 ±2 1. 95 ±0. 71 65. 9 8 29 ±2 29 ±2 2. 97 ±0. 04 49. 1
表 1 M T T 法检测 DADS 对 HL260 细胞的生长抑制率 ( % , x ±s)
组别
细胞生长抑制率
24 h
48 h
72 h
DADS(μg/ ml) 0. 625 1. 25 2. 5 5. 0 10. 0 20. 0
Tween80
A TRA
6. 3 ±7. 1 16. 6 ±4. 9 20. 9 ±8. 6 24. 2 ±3. 4 35. 2 ±4. 9 52. 4 ±5. 8 1. 4 ±3. 4 16. 4 ±5. 2
表 2 NB T 比色还原法检测 DADS 对 HL260 细胞还原反应 的影响 ( % , x ±s)
组别
样本 数
NB T 还原反应阳性率
48 h
72 h
96 h
对照 DADS(μg/ ml) 0. 625 1. 25 2. 5 5. 0
Tween80
A TRA
8 0. 18 ±0. 03 0. 27 ±0. 002 0. 11 ±0. 23
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中华血液学杂志 2004 年 5 月第 25 卷第 5 期 Chin J Hematol , May 2004 ,Vol 25 No. 5
死 ;而 DADS 达 84 mg/ kg 时 ,肾囊膜下 HL260 细胞明显坏 死 。阳性对照组的形态变化不如 DADS 明显 。
表 3 DADS 对小鼠肾囊膜下 HL260 细胞的生长抑制作用
组别
样本 给药前 结束时 数 体重 (g) 体重 (g)
瘤体积 ( mm3)
抑瘤率 ( %)