第四章 酶的提取与分离纯化
2019-2020学年生物技术专业《蛋白质与酶工程》第4章 酶的提取与分离纯化-4
2、电场膜分离
在半透膜的两侧分别装上正负极，电场作用
下小分子带电物或离子向与其本身电荷相反的电 极移动，透过半透膜，达到分离目的。
（1）电渗析
样品液 缓冲液
（2）离子交换膜电渗析
离子交换膜代替一般半透膜
应用：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、 谷氨酸及凝胶电洗脱。
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3、扩散膜分离
组件可在高达350℉ （177℃）的温度下长期 使用。
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陶瓷膜 (无机膜 )
无机膜具有耐高温、耐化学腐蚀、 机械强度高、抗微生物能力强、渗 透量大、可清洗性强、孔径分布窄、 分离性能好和使用寿命长等特点;
过滤孔径一般在0.01μm-4μm之间 选择；通常是一个微滤过程；
茶汁类高温的澄清过滤过程； 葡萄酒、生啤酒的澄清过滤； 牛奶的澄清过滤； 果汁澄清；
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四、凝胶电泳
◙ 支持物：多孔凝胶 ◙ 聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等 ◙ 具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高 ◙ 最常用聚丙烯酰胺凝胶，原因： ◙ 机械强度好、透明有弹性、稳定、无吸附作用
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电泳的基本原理
电泳（electrophoresis）技术: 是指在电场作用下，带电颗粒由于所带电荷
不同及分子大小差异而有不同迁移行为，从而彼 此分离开来的一种实验技术。
由于混合样品中各组分带电性质、带电量、 相对分子质量的不同，在同一电场作用下，泳动 的方向和速率各异，从而达到分离鉴定的目的。
酶工程第4章酶的提取与分离纯化
（3）pH值和温度：等电点附近，室温或低温操作。
（4）蛋白质浓度：样品液的蛋白质浓度一般控制在2.5~3.0% 为宜，太浓时应适当稀释，以减少杂蛋白共沉淀。 （5）脱盐：超滤、透析或层析。
（二）等电点沉淀 (isoelectric precipitation)
抽提液的用量一般为含酶原料体积的2~5倍。可一次抽提，也可分几次 反复抽提。 4、为提高酶的稳定性，可以加入适量的保护剂。
酶分离纯化方法：
现有的纯化方法，都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定 性上的差异以及酶的生物学特性为依据而建立起来的。
分离依据的性质
分离方法
根据分大小、轻重
离心分离、凝胶过滤、膜分离
其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以活力回收率 和纯化倍数为指标；
再者，在纯化工作中，往往不来自百度文库重复采用相同的步骤和条件；
最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋白含量 亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降，酶更不稳定， 因此，更要防止酶变性。
三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节
指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶 充分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的抽提。
（一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂，水。
（二）抽提过程中的注意事项
3酶的分离纯化
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二、物理破碎法
通过温度、压力、声波等各种物理因 素的作用使组织细胞破碎 包括:
1、温度差破碎法; 2、压力差破碎法; 3、超声波破碎法;
1、温度差破碎法
冷冻 高温，用于脆弱易破菌，难以工业化;
于冷藏库或干冰反复于零下15～20℃使之冻固，然后缓慢 地融解，如此反复操作，使大部分细胞及细胞内颗粒破坏。 由于渗透压的变化，使结合水冻结产生组织的变性，冰片 将细胞膜破碎，使蛋白质可溶化，成为粘稠的浓溶液，但 脂蛋白冻结变性。
或:
将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰 浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。
2、压力差破碎法
高压冲击法 用活塞或冲击锤加高压冲击菌体细胞和冰晶石英 沙等混合物。 突然降压法 加压至30MP以上，打开出口阀突然降为常压 爆破性减压法 用氮气或二氧化碳充压至几十至几百大气压。 渗透压差法 利用渗透压的变化而使细胞破碎，常用于从海洋 微生物中提取某些酶。
也是提取蛋白质的最常用溶剂。
一、酶提取的主要方法
1、盐溶液提取
盐溶现象: 在一定浓度的盐存在下,酶的溶解度增加. 盐析现象: 当盐的浓度太高,蛋白的浓度反而下降,从溶液中析出. 一般采用稀盐溶液，0.02~0.05mol/L。 等渗盐溶液尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液和碳酸 盐缓冲液常用。0.15mol/L氯化钠溶液应用也较多。如 6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L碳酸氢钠液提取等。
酶的提取与分离纯化课件
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分ห้องสมุดไป่ตู้
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
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第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
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（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
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离心机的种类
名称
转速(r/min)
注意事项
低速离心机 高速离心机 超速离心机
6000 6000〜 25000 >25000
常温，注意样品热变性和离心 管平衡
冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
冷冻＋真空系统（减少空气阻 力和摩擦）， 离心管的精确平衡
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
纯化工艺评价
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基因工程酶/蛋白分离纯化的一般流程
第一节 酶的分离
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。
3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
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(三) 有机溶剂沉淀
在待分离的酶液中加入与水互溶的有机溶剂 使溶液介电常数降低，酶蛋白分子间引力增大而 相互产生聚集，从而降低溶解度而析出沉淀。
37 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
（二）离心法测定蛋白质相对分子质量
Mr—相对分子质量；
R—气体常数，常取8.314J﹒mol-1﹒K-1；
T—温度（K）；
D—粒子在介质中的扩散系数（m2﹒s-1）；
V—偏微比容（m3﹒kg-1）；
ρo—介质密度。
38 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
操作注意稳、盖、旋紧。
24 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
离心机的大小：台式
25 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
离 心 机 的 大 小 ： 落 地 式
26 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
离心管
材质：玻璃， 塑料
强度：和离 心速度相配
大小：和转 子配套
高速超速管 要加盖
PAA + 酶 PAA-酶 pH6以上
PAA-酶 PAA + 酶
PAA + 酶 + Ca 2+
酶工程 第四章酶的分离纯化 第二节酶的提取
第四章 酶的分离纯化
第二节 酶的提取
酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质， 选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水，可用水 或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂质结 合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提 取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件。
第二节 酶的提取
4.有机溶剂提取 有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多 的酶，不溶或难溶于水、稀酸、稀碱和稀盐溶液中，需用 有机溶剂提取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、 丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取 效果较好，已成功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、 胆碱酯酶等的提取。
第二节 酶的提取
一、酶提取的主要方法
根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不 同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸 溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。
第二节 酶的提取
1.盐溶液提取
大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下， 酶的溶解度增加，这称之为盐溶现象，然而盐浓度不能太 高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用 稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.02～ 0.5mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的 α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mo1/L的氯 化钠溶液或0.02～0.05mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇 脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；6-磷酸 葡萄糖脱氢酶用0.1mol/L的碳酸钠提取；枯草杆菌碱性磷 酸酶用0.1mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生 的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。
第四章 酶的分离纯化
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2.1离心机的选择 常速离心机 高速离心机 超速离心机
常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以
内，相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化 过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的 分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。
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高速离心机：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀法
1.1 盐析
Ks分段盐析：在一定的温度和pH值条件下（β为常数），利用 不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值) 使不同的酶或蛋白质分离的方法。
Ks：代表盐析效率 。其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度， Ks越大盐析效果越好。 β ：表示温度一定时，离子强度为0时某一蛋白质的溶解度.
Go Go
Go Go
2
第一节 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶提取
酶分离纯化
酶浓缩
酶贮存 离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
3
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 取样 → 均质打破
第四章 酶的分离与纯化
目的：
• 改变发酵液物理性质 • 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 • 去除部分杂质
1、发酵液的相对纯化
（1）无机离子的去除 • Ca2+ 常用草酸 • Mg2+ 三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ • Fe3+ 黄血盐[K4Fe(CN)6],形成普鲁(Fe4[Fe(CN)6]3)沉淀
业：高速珠磨机
• 高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度
细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G+菌，含有包含体 （Inclusion body）的基因工程菌不宜用此法。
• 超声波法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎； G-比 G+容易
破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？？
几种膜分离技术特点
1、透析(dialysis) 原理 P159 1)透析膜 纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。 2)透析袋预处理 3)透析方法及装置 2.超滤 原理 P164-165
利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤 （常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分 子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这 种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤 膜的截留分子量范围从5000到500000。
酶的分离纯化
❖此法分辨率较高、溶剂易除去，但易引起 酶的变性失活。
3、等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 以及不同的两性电解质具有不同的等电点 这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或 杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方 法称为等电点沉淀。
溶 等电点沉淀、 解 盐析、有机 度 溶剂沉淀、
电 萃取 荷 离子交换层析
等 、电泳 电 层析聚焦、等 点 电聚焦
分 离心分离、凝
① 比活力提高倍数是纯化后样品的酶比活力 与纯化前比活力的比值，较大的倍数表示 比活力明显提高，说明操作的有效性。
② 总活力的回收率是指纯化后样品的总活力 占前样品总酶活的百分比。这一比值越高 说明该操作步骤对酶活的保存率越高。
2、建立一个可靠、快速的分析方法
目标酶蛋白，蛋白质纯度的检测，总蛋白 量的检测，对必须清除的杂质的分析
纯化方法的选择--解决纯化倍数和回收 率的矛盾
建立以下分析通道： ① 快速、可靠的分析目标酶蛋白的方法（酶
活力测定方法） ② 蛋白质纯度检测方法 ③ 总蛋白的检测方法 ④ 对必须清除的杂质分析方法
与水相容的有机溶剂（甲醇、乙醇和丙酮等） 能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。
❖有机溶解的主要作用是降低溶液的介电常 数，因为分子中的静电引力和溶剂的介电 常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子 间的引力增加，互相吸引凝聚，使其溶解 度降低。
酶工程4-1--3 酶的提取与分离提纯 酶的提取与分离提纯
二、细胞对破碎方法的敏感性
细胞 声波 机械 渗透压 冻融 ———————————————————— 动植物 +++ +++ +++ +++ 革兰氏阴性菌 ++ ++ ++ ++ 革兰氏阳性芽孢菌 ++ + ++ + 酵母 + + + + 革兰氏阳性球菌 + + + 菌丝 ++ ++ 孢子 -
三、细胞破碎效果确认
一、盐析沉淀法（改变离子强度）
1. 基本原理（盐溶和盐析） 向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐， 可产生两种现象： 1) 盐溶 低浓度的中性盐增加蛋白质的溶度。 2) 盐析 高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
蛋白质的盐析
• 原因： 高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水 分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度 而沉淀。 不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在 不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同 蛋白质先后析出，称分段盐析。
该法适用于膜结合酶、细胞间质酶等的提取, 但是对革兰氏阳性菌不适用。主要 由于革兰氏阳性菌的细胞壁由肽多糖组成, 可以承受渗透压的变化而不致细胞破裂。
酶工程04酶的分离纯化资料
（一）pH：.稳定性、抽提效果、纯度 （二）盐；.盐溶现象、盐析现象，一般采用稀盐溶液， 浓度在0.02－0.05mol/L （三）温度；考虑稳定性，通常控制在0－4℃左右，一般 不宜超过10℃ （四）抽提液用量：用量大提取率高，但酶浓度下降，不 利于进一步纯化，一般为含酶原料体积的1－5倍，可一次 提取，也可分几次提取。 （五）添加保护剂。
单晶样品制备
１、单晶的概念及识别（晶体结构特征、几何外 型特征、光学性质特征
２、单晶分析样品的要求、选择和安装
上机的样品尽可能选择呈球形（粒状）的单晶体 或晶体碎片，直径大小在0.1-0.7mm，无解理、无 裂纹 •确保用于单晶衍射的样品代表要鉴定的物相，从 晶体的形状、颜色、解理和其他的分析方法给予 保证。
酶的分离纯化方法是依据酶和 杂蛋白在性质上的差异而建立 起来的。
1.根据分子量设计的方法：离心法、凝胶过滤法。
2.根据溶解度大小：盐析法，有机溶剂沉淀法，选择性沉淀法， 等电点沉淀法。
3.根据电荷的多少和性质：离子交换法，电泳法等。
4.根据稳定性差异；选择性热变性，选择性酸碱变性法。 5.根据亲和（互补）作用：亲和层析。
[E]mol=（酶的克数/酶的分子量）×活性中心数
三 比活力 四 酶活力测定方法
酶活力受许多因素影响，酶活力测定通常有两种方 法即终止反应法和连续反应法。 （一）终止反应法
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
酶的提取、分离、纯化及其活力测定
一、实验目的
酶是植物体内具有催化作用的蛋白质，植物体内的生化反应，一般都
是在酶的作用下进行的，没有酶的催化反应，植物的生命也就停止了，因此对酶的研究是阐明生命现象本质中十分重要的部分。为要研究酶
首先要将酶从组织中提取出来，加以分离、纯化，不同的研究目的对
酶制剂的纯度要求也不相同，有些工作只需要粗的酶制剂即可，而有
些工作则要求较纯的酶制剂，需根据不同情况区别对待。在酶的提取
和纯化过程中，自始至终都需要测定酶的活性，通过酶活性的测定以
监测酶的去向。
二、实验原理
（一）酶的提取
1.酶的存在位置？
存在于动植物以及微生物的细胞的各个部位。
2.如何将酶从细胞中分离？
从高等植物中提取酶常遇到一些实际问题，首先是细胞中含有许多种酶，每种酶的浓度又很低，只占细胞总蛋白质中的极小部分（叶中的
双磷酸核酮糖羧化酶除外），而许多植物组织中蛋白质的含量又很低。此外，各种酶的存在状态不同，有在细胞外的外酶，在细胞内的内酶，内酶中又有与细胞器一定结构相结合的结合酶，也有的存在于细胞质中，提取时都应区别对待，作不同处理。如果酶仅存在于细胞质中，
只要将细胞破碎，酶就会转移到提取液中；但如果是与细胞器（如细
胞壁、细胞核、线粒体、原生质膜、微粒体等）紧密结合的酶，这时
如仅仅破碎细胞还不够，还需要用适当的方法将酶从这些结构上溶解
下来。其次，细胞中存在抑制物质，如酚，酸，离子等，它们通常在
液泡中，当细胞破碎时，这些物质象蛋白质一样从细胞中释放出来，进入提取液中，特别是酚类物质，具有游离的酚羟基，能与蛋白质肽键的氧原子形成强的氢键，不能为一般的实验方法，如透析和凝胶过滤所解离。酚易氧化产生醌，醌为一种强氧化剂，会使蛋白质的功能团发生氧化或发生聚合，使蛋白质上的反应基团，如—SH，—NH2，通过1，4—加成反应而发生不可逆的聚合作用，使酶失活，也使植物组织和提取液产生棕色，以致影响酶活性的测定。因此如果没有特殊需要，一般常选用植物的非绿色部分或者黄化的幼苗，在这些组织中一般酚类化合物含量较低。在提取过程中为了尽量减少酚类的影响，一般提取液常选用高pH值的缓冲溶液，因为在高pH值时，酚类大部游离而不与蛋白质形成强的氢键，但高pH值促进酚类氧化，同时降低酚类吸附剂（如PVP）的有效性，通常采用pH6.7�_7.2。已经知道PVP能与游离酚羟基形成强的氢键复合物，是酚类化合物的有效结合剂。在提取线粒体时加入可溶性PVP，提取可溶性酶时加入不溶性交联PVP（Pol yvinyl polypyrrolidone，简称PVPP，或Polyclar AT），能有效地降低提取液中酚的含量。PVPP含有微量金属元素及PVP单体，可加10% HC l煮沸10分钟，用NaOH中和，再用水洗几次，直至中性，纯化后的PVPP 不必干燥就可直接应用。
4酶的提取与分离纯化
RCF = m r （2 N/60）2 /mg= 1.12 10-5 N2 r 此公式描述了相对离心力与转速之间的关系 旋转半径用r平均代替 r平均=1/2（r大+r小）cm
通常：
•低速离心以每分钟的转数表示，如：4000r/min。 •高速离心（超速），常以相对离心力（RCF）表
示，如：65000g。 两者可换算或查测算图。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
对酶稳定性好、溶解度大 ，最常用。 （二）酸、碱溶液提取 （三）有机溶剂提取
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除 去与产物性质相似的杂质。
浓缩与干燥（concentration and desiccation） （成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。
采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速 度不同的颗粒分批分离的方法。
特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。 优点：操作简单 。 缺点：1）分离效果较差， 不能一次得到纯颗粒。
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第四章酶的提取与分离纯化
1、细胞破碎的目的、方法。
•大多数酶都存在于细胞内部，为了获得细胞内的酶，首先要收集细胞并进行细胞破碎，使细胞的外层结构破坏，然后进行酶的提取与分离纯化。
•机械法
•物理法
•化学法
•酶促破碎法（酶解）
2 选择细胞破碎方法的依据。
•（1）细胞的处理量：大规模用机械法，小规模用非机械法。
•（2）细胞壁的强度与结构
•（3）目标产物对破碎条件的影响。机械法考虑剪切力，酶法考虑对目标产物是否具有降解作用。
•（4）破碎程度：高压匀浆法，细胞碎片细小，固液分离困难。
•（5）提取分离的难易
3. 酶抽提的目标及方法。
提取目标：
• a. 将目的酶最大限度地溶解出来。
• b. 保持生物活性。
提取原则
• a. 相似相溶。
• b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
4．三种离心方法（差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心）的特点。
（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
（2）密度梯度离心特点：：
•区带内的液相介质密度小于样品物质
•颗粒的密度。
•适宜分离密度相近而大小不同的固相
•物质。
（3）等密度梯度离心特点：
•介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
•适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
5. 酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。
种类：
⑴中性盐沉淀（盐析法）
基本原理（盐溶和盐析）
向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：
1) 盐溶（salting in）：
低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。
2) 盐析（salting out）：
高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。
⑵有机溶剂沉淀
利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。
1. 沉淀机理
降低溶液的介电常数
部分地引起蛋白质脱水
2. 常用有机溶剂
丙酮>乙醇>甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。
⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性）
选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。
⑴热变性
几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。
⑵ pH变性
等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。
⑶有机溶剂变性
使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。
⑷等电点沉淀
原理：
蛋白质在等电点时溶解度最低
不同的蛋白质具有不同的等电点
⑸有机聚合物沉淀
作用机理：
与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。
沉淀剂：
常用聚乙二醇（简写 PEG ）
多用分子量为6000～20000的 PEG。
6. 双水相萃取、超临界流体萃取的概念。
•超临界萃取，又称为超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中的溶解度不同而达到分离的一种萃取技术。
•利用溶质在两个互不相溶的水相中的溶解度不同而达到分离。
7. 膜分离的原理及应用。
•膜分离过程中，薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把大于其孔径的颗粒截留。
•应用（自己整理）超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。
•反渗透：海水淡化
•电场膜分离：脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。
8. 比较吸附层析、疏水层析、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析，高效液相色谱的概念及原理上的不同点。
•吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的层析方法。
•离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。
•凝胶层析又称为凝胶过滤、分子排阻层析、分子筛层析等，是指以各种凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。
•亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。
•HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。
9. 比较连续与非连续、变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳区别。
连续电泳：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统，只有分离胶；
不连续电泳：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系，有分离胶和浓缩胶。
连续PAGE：电荷效应、分子筛效应
不连续PAGE：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应
1）电荷效应 : 分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。
2）分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。
3）浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。
系统的不连续性表现在以下几个方面：
1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
3.在电场中形成不连续的电位梯度。
因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：加了SDS
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：不加SDS
10. 蛋白质浓度测定方法及酶活力测定方法。
蛋白质浓度测定
1.紫外吸收法：酪氨酸、色氨酸残基中苯环有共轭双键，在A280有最大吸收。
特点：简便、快速、不损耗样品，但干扰因素多。
2. 双缩脲法：具有两个或两个以上肽键的化合物均有双缩脲反应。
优点：快速；缺点：灵敏度差
3. 酚试剂（Folin-酚）测定法：繁琐，但灵敏度、准确度高。
4. 染料结合法（考马斯亮蓝染色法）：又称Bradford法，灵敏、简便、快速、干扰少，是近年来常用的检测法。
11. 比活力、提纯倍数、回收率的含义及用途。
酶的比活力(纯度)=活力单位数/毫克蛋白
比活力越高，酶纯度也越好。表示酶制剂纯度的一个指标。
纯化倍数=提纯后比活力/提纯前比活力
表示提纯过程中纯度提高的倍数。提纯倍数越大，表示该方法纯化效果越好。
总活力＝酶活力单位数 酶液总体积
即样品中全部酶活力。
回收率＝提纯后酶总活力/提纯前酶总活力×100％
表示提纯过程中酶损失程度的大小。回收率越高，损失越小。
判断一个分离纯化方法的优劣，常用总活力的回收率和比活力的提纯倍数两个指标。
回收率：反映酶的损失情况。